[发明专利]基于发夹结构DNA为模板的铜纳米簇荧光探针快速定量检测溶液中链霉素的方法

说明书

本发明公开了基于发夹结构DNA为模板的铜纳米簇荧光探针快速定量检测溶液中链霉素的方法，是将发夹结构DNA为模板的铜纳米簇作为荧光探针，利用核酸适配体的识别作用，免标记、快速、高灵敏度、高特异性定量检测复杂体系中链霉素含量。具体来说，以核酸适配体作为识别因子，以聚AT‑TA双链DNA模板合成的铜纳米簇作为荧光探针，通过荧光强度变化特异性检测溶液中链霉素含量。该方法简单、快速，检测线性范围宽，检出限低，具有较好的检测灵敏度和特异性，在食品、药品、化妆品、环境等方面具有很好的应用前景。

技术领域

本发明涉及一种链霉素检测方法，具体涉及一种基于发夹结构DNA为模板的铜纳米簇荧光探针快速定量检测溶液中链霉素的方法。属于生物检测技术领域。

背景技术

链霉素是最基本的一种氨基糖苷类抗生素，是由灰色链霉菌产生的一种抗菌有机碱，在人类、兽医和农业中都有广泛的应用。在农业上，它用于控制某些水果、蔬菜、种子、大田作物、观赏作物的细菌和真菌病害，在观赏池塘和水族馆中用于控制藻类。其不合理使用会导致其残留于动物体内，并通过食物链富集进入人体从而造成不良影响。由于链霉素及其衍生物有肾毒性和耳前庭毒性，也有研究表明链霉素还具有潜在的致畸作用。食品中的链霉素残留已引起各国高度重视。我国GB 3150-2009《食品中兽药最大残留量》中规定，牛奶中链霉素最大残留限量为200μg/kg，畜禽肌肉、脂肪、肝脏中为600μg/kg，肾脏中为1000μg/kg。欧盟规定，乳品中链霉素最大残留限量为200μg/kg，肌肉、脂肪、肝脏中为500μg/kg，肾脏中为1000μg/kg。

目前，链霉素的常用测定方法包括液相色谱法、液相色谱-串联质谱法、免疫分析法、分光光度法、微生物法等。虽然上述测定方法具有较高的准确度和灵敏度，但也存在着一些局限性，如仪器昂贵、测定时间长、样品制备过程复杂、需要专业的操作人员等。因此，需要建立一种简单、经济、快速、便携的测定链霉素的方法。

发明内容

本发明的目的是为克服上述现有技术的不足，提供一种基于发夹结构DNA为模板的铜纳米簇荧光探针快速定量检测溶液中链霉素的方法，采用铜纳米簇作为荧光探针，运用核酸适配体的识别作用，实现对溶液中链霉素含量进行免标记、快速定量检测。

为实现上述目的，本发明采用下述技术方案：

1、基于发夹结构DNA为模板的铜纳米簇荧光探针的制备方法，先将DNA冻干粉利用MOPS缓冲液溶解制成DNA溶液；然后将DNA溶液与第一部分磷酸缓冲盐溶液(PBS)混合得到混合液，90℃保温10分钟，自然冷却至室温(25℃)，得到发夹结构DNA；接着将发夹结构DNA与第二部分磷酸缓冲盐溶液、硫酸铜溶液、抗坏血酸溶液混匀，室温避光反应3分钟，得到荧光铜纳米簇溶液，即为所述的荧光探针。

优选的，DNA的序列如下：

5’-ATATATATATATGGCCCGTTTAAAGTAGTTGAGAGTATTCCGTTTCTTTGTGTCATATATATATAT-3’，如SEQ ID NO.1所示。

优选的，MOPS缓冲液包含：3-吗啉丙磺酸20mmol/L，氯化钠300mmol/L，pH＝7.5。

优选的，DNA溶液、第一部分磷酸缓冲盐溶液、第二部分磷酸缓冲盐溶液、硫酸铜溶液、抗坏血酸溶液的体积比为5：40：35：10：10，其中，DNA溶液、硫酸铜溶液、抗坏血酸溶液的浓度依次为10μmol/L、2mmol/L、10mmol/L。

进一步优选的，所述的第一部分磷酸缓冲盐溶液、第二部分磷酸缓冲盐溶液的组成相同，配方如下：磷酸二氢钾0.24g/L，磷酸氢二钠1.44g/L，氯化钠8g/L，氯化钾0.2g/L，pH＝7.4。

2、利用上述制备方法得到的基于发夹结构DNA为模板的铜纳米簇荧光探针。

3、上述铜纳米簇荧光探针在链霉素定量检测中的应用。