[发明专利]一种用于检测茎环核酸的荧光等温扩增方法、扩增体系与应用

说明书

本发明提供了一种用于检测茎环DNA或RNA的荧光等温扩增方法、扩增体系与应用。所述荧光等温扩增方法包括：(1)以待测核酸样品中的茎环DNA或RNA为模板，合成特异性扩增引物；(2)使用所述特异性扩增引物、高保真DNA聚合酶和链置换DNA聚合酶进行荧光等温扩增，并检测扩增体系中的荧光，得到检测结果。本发明所述特异性扩增引物包括外引物和内引物，可扩增多种茎环结构且设计方法简单；其中，内引物携带荧光基团和淬灭基团，其3'端末端的碱基与模板互补配对或错配。本发明提供的荧光等温扩增方法具有高度的灵敏性和特异性，并且具有良好的检测限，其多重检测限均可低至3copies/反应。

技术领域

本发明属于核酸检测技术领域，具体涉及茎环核酸的检测，尤其涉及一种用于检测茎环核酸的荧光等温扩增方法、扩增体系与应用。

背景技术

核酸检测已应用于临床分子诊断、食品安全监测、基因表达分析和基础分子生物学等多个领域。目前，实时荧光定量RT-PCR(Real-Time RT-PCR)是核酸检测的金标准，然而，RT-qPCR检测依赖于大型综合医院的卫生保健设施或政府实验室(如CDC)的先进设施，需要可靠的电力供应和训练有素的人员，而且相对耗时(约1.5～2小时)，这些限制了RT-PCR在即时诊断方面以及资源有限地区的应用。

一系列核酸等温扩增的检测方法被建立起来，比如链替换扩增技术(SDA)、基于核酸序列的扩增(NASBA)、滚环扩增(RCA)、环介导等温扩增(LAMP)及交叉引物扩增(CPA)等。这些方法在等温条件下进行扩增，因此对仪器的要求显著下降，更适合于POCT(即时检验，Point-of-care testing)。

现有核酸等温扩增的检测方法主要基于嵌入式染料法，并且常用非特异性结合染料。例如，CN109777861A公开了一种错配耐受的环介导等温扩增方法及应用。所述方法对于扩增反应的反应体系进行了优化，特别是DNA聚合酶的选用，该方法可良好地应用于基于环介导等温扩增的检测，与传统方法相比，简便、快速、灵敏、准确，具有更高的检出率和更短的检测时间。然而，该方法基于嵌入式染料法，容易造成假阳性结果，并且也无法对多种病原同时进行检测。

目前，恒温扩增主要是通过链置换恒温扩增酶，以及复杂的引物设计，引入茎环结构，实现扩增。另外，很多DNA或RNA分子局部易形成茎环等复杂结构，目前并无直接利用DNA或者RNA茎环结构实现恒温扩增的方法。

针对所述问题，本领域迫切需要开发简便、快速、灵敏、准确的用于检测多种茎环DNA的荧光等温扩增方法。

发明内容

针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种用于检测茎环DNA或RNA的荧光等温扩增方法、扩增体系与应用。将Bst DNA聚合酶结合高保真DNA聚合酶以及荧光探针，提供一种高灵敏，高特异性的用于检测多种茎环DNA的荧光等温扩增法。本发明的又一目的在于提供一种用于检测多种茎环DNA的荧光等温扩增体系。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供一种用于检测茎环DNA的荧光等温扩增方法，所述荧光等温扩增方法包括如下步骤：

(1)以待测核酸样品中的茎环DNA为模板，合成特异性扩增引物；

其中，所述特异性扩增引物包含第一引物和第二引物；

所述第一引物包括至少一条外引物，所述外引物包括FOP和/或BOP；

所述第二引物包括至少一条携带荧光基团和淬灭基团的内引物，所述内引物包括LIF和/或LIB，并且，所述第二引物的3'末端的碱基为与模板互补配对的碱基或与模板错配的碱基；

(2)使用所述特异性扩增引物和链置换DNA聚合酶进行荧光等温扩增，并检测扩增体系中的荧光，得到检测结果。