[发明专利]一种用于检测茎环核酸的荧光等温扩增方法、扩增体系与应用

权利要求书

1.一种用于非疾病诊断目的的检测茎环核酸的荧光等温扩增方法，其特征在于，所述荧光等温扩增方法包括如下步骤：

(1)以待测核酸样品中的茎环DNA或RNA为模板，合成特异性扩增引物；

其中，所述特异性扩增引物包含第一引物和第二引物；

所述第一引物为2条外引物FOP和BOP，并且，所述第一引物根据所述模板的茎环处的核苷酸序列进行设计，分为结合茎部和环的两部分序列；

所述第二引物为携带荧光基团和淬灭基团的内环引物LIF和/或LIB，并且，所述第二引物的3'末端的碱基为与模板互补配对的碱基或与模板错配的碱基，且错配碱基数可以为1～5个碱基，所述第二引物的3'端携带荧光基团，并且5'端携带淬灭基团；

(2)使用所述特异性扩增引物和链置换DNA聚合酶进行荧光等温扩增，并检测扩增体系中的荧光，得到检测结果；

步骤(1)中所述特异性扩增引物还包括第三引物，所述第三引物为至少一条未经荧光基团和淬灭基团修饰的内环引物，其与第二引物的序列相同；

步骤(2)的反应体系中还包括高保真DNA聚合酶；

所述高保真DNA聚合酶为Q5 DNA聚合酶。

2.根据权利要求1所述的荧光等温扩增方法，其特征在于，所述荧光基团包括FAM、Cy5、Texas Red、HEX、VIC、TET、JOE、TAMRA、ROX、LC Red610、LC Red640、LCCyan500或YakimaYellow中的任意一种或至少两种的组合；

所述淬灭基团包括BHQ1、BHQ3、Eclipse、TAMRA、BHQ2或Dabcyl中的任意一种或至少两种的组合。

3.根据权利要求2所述的荧光等温扩增方法，其特征在于，步骤(2)中所述链置换DNA聚合酶包括Bst 3.0DNA/RNA聚合酶或Bst 4.0DNA/RNA聚合酶。

4.根据权利要求1所述的荧光等温扩增方法，其特征在于，以茎环RNA为模板，步骤(2)的反应体系中还包括反转录酶，或者，所述反应体系中的链置换DNA聚合酶为具有逆转录活性的链置换DNA聚合酶。

5.根据权利要求1所述的荧光等温扩增方法，其特征在于，步骤(2)中所述荧光等温扩增的扩增温度为61～65℃；

步骤(2)中所述荧光等温扩增的扩增时间为5～70min。

6.根据权利要求5所述的荧光等温扩增方法，其特征在于，步骤(2)中所述荧光等温扩增的扩增温度为64℃；步骤(2)中所述荧光等温扩增的扩增时间为30min。

7.一种使用权利要求1～6任一项所述的荧光等温扩增方法检测茎环核酸的荧光等温扩增试剂盒，其特征在于，所述荧光等温扩增试剂盒包括：

链置换DNA聚合酶、特异性扩增引物、dNTPs、Mg²⁺和缓冲液；

其中，所述特异性扩增引物包含第一引物和第二引物；

所述第一引物为2条外引物FOP和BOP，并且，所述第一引物根据所述模板的茎环处的核苷酸序列进行设计，分为结合茎部和环的两部分序列；

所述第二引物为携带荧光基团和淬灭基团的内环引物LIF和/或LIB，并且，所述第二引物的3'末端的碱基为与模板互补配对的碱基或与模板错配的碱基，且错配碱基数可以为1～5个碱基，所述第二引物的3'端携带荧光基团，并且5'端携带淬灭基团；

所述特异性扩增引物还包括第三引物，所述第三引物为至少一条未经荧光基团和淬灭基团修饰的内环引物，其与第二引物的序列相同；

所述荧光等温扩增试剂盒还包括高保真DNA聚合酶；

所述高保真DNA聚合酶为Q5 DNA聚合酶。

8.根据权利要求7所述的荧光等温扩增试剂盒，其特征在于，所述第一引物的浓度为0.6～1.2μM；

所述第二引物的浓度或第二引物与第三引物的总浓度为0.2～0.6μM。