[发明专利]一种N糖基转移酶突变体F13及其应用

说明书

本发明公开了一种N糖基转移酶突变体F13，是对来源于胸膜肺炎放线杆菌中的N‑糖基转移酶基因经过N471I、S275A、P497R三点突变获得；其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明还公开了所述突变体F13作为多肽糖基化修饰的工具酶将含有N‑X‑S/T序列的多肽进行糖基化形成糖肽或糖蛋白中的应用。本发明的突变体F13相较野生型NGT糖基化效率和底物范围显著提高，能够广泛糖基化野生型NGT不能糖基化的片段例如IgG片段并且能够利用野生型不能利用的糖供体UDP‑GlcA，可以实现简单快速的利用UDP‑Glc/UDP‑Gal/UDP‑GlcA将含有N‑X‑S/T序列的多肽进行糖基化修饰，并可进一步利用其他的糖基转移酶对糖肽的糖链进行修饰获得目的糖肽。这为多肽与蛋白的糖基化修饰提供了一种新途径，为糖蛋白疫苗的合成提供了一种简便方法。

技术领域

本发明涉及一种糖基转移酶及其应用，尤其涉及一种来源于胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae)中的N-糖基转移酶的突变体(命名为F13)及其应用，属于分子生物学中糖工程技术领域。

背景技术

蛋白质的糖基化修饰对蛋白质的功能和理化性质影响极大，大部分抗体及细胞因子是N-糖基化的。抑制蛋白的糖基化往往影响蛋白正确折叠、代谢和蛋白的功能。也有研究发现将糖与载体蛋白相结合，形成的糖蛋白疫苗可以刺激机体产生免疫记忆，因此糖蛋白疫苗的研究引起了广泛关注。而糖蛋白的获得以往是通过生物体内直接提取，或者是体外进行化学合成，这两种方法均存在步骤繁杂，成本较高的缺点。

已经报道的胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae)来源的NGT能够直接利用游离的UDP-Glc和UDP-Gal糖基化具有N-X-S/T(X≠Pro)序列的多肽，步骤简单，成本较低，但是野生型NGT并不能糖基化所有具有N-X-S/T(X≠Pro)序列多肽，例如IgG的Fc片段，并且不能利用UDP-GlcA作为糖供体。目前已报道的ApNGT的突变中糖基化效率得到了提升，但是尚未报道能够糖基化IgG的Fc片段的突变体以及能够利用UDP-GlcA作为供体的N-糖基转移酶及突变体。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种来源于胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae)中的N糖基转移酶突变体及其在对多肽进行N连接糖基化修饰中的应用。

本发明所述的种N糖基转移酶突变体，是对NCBI Reference Sequence:WP_005605627.1的来源于胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae)中的N-糖基转移酶基因经过N471I、S275A、P497R三点突变获得；其特征在于：所述突变体命名为N糖基转移酶突变体F13，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，该突变体相较野生型NGT糖基化效率和底物范围显著提高，能够广泛糖基化野生型NGT不能糖基化的片段并且能够利用野生型不能利用的糖供体UDP-GlcA。

上述N糖基转移酶突变体F13是通过将野生型N糖基转移酶(NCBI ReferenceSequence:WP_005605627.1)胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae)中的N-糖基转移酶基因构建于载体pET45b上，利用诺唯赞一步法多点突变试剂盒(C25-01)构建突变F13(N471I、S275A、P497R三点突变)，经过生工生物工程股份有限公司测序正确后，通过大肠杆菌BL21发酵诱导表达、纯化回收获得。

本发明所述N糖基转移酶突变体F13在对多肽进行N连接糖基化修饰中的应用。

进一步的，本发明所述N糖基转移酶突变体F13作为体内多肽糖基化修饰的工具酶在利用UDP-Glc或UDP-Gal或UDP-GlcA将含有N-X-S/T序列的多肽进行糖基化形成糖肽或糖蛋白中的应用。