[发明专利]一种基于荧光共振能量转移的GPC3检测方法

说明书

一种基于荧光共振能量转移的GPC3检测方法，以GPC3适配体为识别探针，GPC3适配体能够特异性识别和结合GPC3蛋白，基于纳米金‑碳量子(AuCDs)‑GPC3适配体和磁性石墨烯(Fe₃O₄/GO)间的荧光共振能量转移原理，建立一种检测GPC3的荧光适配体生物传感器，用以检测血清中GPC3的含量。该方法操作简单、费用低，具有较低的检测限。

技术领域

本发明属于光学传感技术领域，具体涉及一种基于荧光共振能量转移的GPC3检测方法。

背景技术

磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3（GPC3）是一种硫酸类肝素蛋白多糖。常用的GPC3检测方法是酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)，利用抗原和抗体间的特异性反应进行分析检测，但是ELISA存在价格高、稳定性差、不易储存和运输等问题。适配体(aptamer)，被称为“人工替代抗体”，是一种人工设计的单链寡核苷酸(ssDNA或RNA)，具有以三级结构(如发卡、口袋、凸环等)特异识别靶分子的作用。发明专利CN 106636108 A公开了一种特异性结合GPC3的核酸适配体及其应用，利用结合毛细管电泳的SELEX技术筛选与肝癌标志物GPC3特异性结合的适配体，获得具有特异结合GPC3的适配体序列G625，并利用该GPC3适配体制备肝癌血清诊断试剂、肝癌组织切片染色试剂以及肝癌相关的活体成像造影剂。荧光共振能量转移（fluorescence resonance energy transfer, FRET）是在一个荧光基团（供体）的激发状态下由一对偶极子介导的能量从供体向另一个荧光基团（受体）转移的过程， FRET传感器系统需要两个不同的荧光基团，传统的有机荧光基团价格昂贵，且荧光不稳定，容易发生不可逆的光漂泊，不适合可靠长期检测。开发新型低成本的FRET传感体系用于肿瘤标记物检测始发展方向。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种基于纳米金碳量子点（AuCDs）和磁性石墨烯（Fe₃O₄/GO）的荧光共振能量转移的GPC3检测方法，该方法能达到3.01 ng/mL的检测限。

为了解决该技术问题，采用AuCDs作为荧光物质，将巯基化GPC3适配体（GPC3_Apt）与AuCDs通过Au-S键进行结合，形成荧光标记的AuCDs-GPC3_Apt复合物。在AuCDs-GPC3_Apt溶液中加入Fe₃O₄/GO分散液，AuCDs-GPC3_Apt复合物与Fe₃O₄/GO通过范德华力结合在一起，发生荧光共振能量转移，使AuCDs-GPC3_Apt的荧光能量转移到了Fe₃O₄/GO上，整个系统的荧光强度就会变低；加入GPC3蛋白后，由于GPC3_Apt的特异性，GPC3会优先与AuCDs-GPC3_Apt结合，适配体构象改变，从Fe₃O₄/GO底面分离，抑制了荧光共振能量转移，从而使AuCDs-GPC3_Apt的荧光得到恢复。根据反应体系中荧光强度恢复程度的变化，建立GPC3浓度和AuCDs-GPC3_Apt的荧光强度变化的线性关系，实现了GPC3的快速灵敏、选择性好的定量检测。

本发明按照以下步骤进行：

步骤1：荧光共振供体AuCDs-GPC3_Apt的制备

(1)AuCDs的制备：往葡萄糖溶液添加HAuCl₄溶液，搅拌均匀，滴加脱水柠檬酸三钠（SCT）溶液继续搅拌、加热，反应完成后冷却、离心，得到AuCDs溶液；