[发明专利]检测多特异性抗体轻链错配的方法

说明书

使用蛋白质水解酶的多特异性抗体的限制性消化对分析多特异性抗体轻链配对的用途。

本申请为2015年4月1日提交的，发明名称为“检测多特异性抗体轻链错配的方法”的PCT申请PCT/EP2015/057164的分案申请。所述PCT申请进入中国国家阶段的申请号为201580018014.9。

本文报告了基于限制性蛋白质水解消化和ESI-MS分析确定多特异性抗体制剂中轻链错配的方法。该方法可以被用于质量控制或细胞系选择。

发明背景

1995年，Yamaguchi等人(J.Immunol.Meth.181(1995)259-267)报告了小鼠免疫球蛋白G的高特异性蛋白水解片段化的方法，该方法使用赖氨酰内肽酶、梭菌蛋白酶、金属内肽酶和V8蛋白酶，由此在反应条件下检测的梭菌蛋白酶、赖氨酰内肽酶、金属内肽酶和V8蛋白酶选择性地不切割铰链区的lgG1和lgG1-CM。

Matsuda等人(FEBS Lett.473(2000)349-357)报告了使用Lys-C制备Fc片段的方法，通过MS获得Fc相关糖型的信息，用于确定免疫球蛋白G的Fc区中寡糖的配对。

Villanueva等人(J.Mass Spectrom.37(2002)974-984)报告了限制性蛋白质水解方法，该方法基于使用结合基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)的非特异性外蛋白酶，以快速从两端(N-和C-端)绘制蛋白质的二级结构要素。

在WO 2005/073732中报告了高分子量蛋白质的分析方法，具体而言，报告了高分子量蛋白质(包括抗体)的反相LC/MS分析方法。

WO 2006/047340涉及用柱使用还原/氧化试剂和离液剂分离多肽的制剂，并分离从所述接触产生的再折叠活性蛋白质。活性蛋白可以是高分子量蛋白质，包括含有Fc结构域的多肽或片段。

Kleemann等人(Anal.Chem.80(2008)2001-2009)报告了通过限制性蛋白质水解并结合LC-MS，表征IgG1免疫球蛋白和肽-Fc融合蛋白。使用内蛋白酶Lys-C的限制性蛋白质水解导致主要切割该赖氨酸残基的C-端。

发明概述

业已发现，对于(多特异性)抗体的多特异性抗体限制性蛋白质水解中轻链错配的确定，必须在MS分析之前进行，因为完整多特异性抗体中轻链错配的确定被等压质量的干扰阻碍。

因此，如本文中报告的一个方面是使用蛋白质水解酶的多特异性抗体的限制性消化对分析多特异性抗体轻链配对的用途。

如本文所报告的一个方面是使用蛋白质水解酶的多特异性抗体的限制性消化对确定多特异性抗体中轻链错配的用途。

如本文所报告的一个方面是使用蛋白质水解酶的重组哺乳动物细胞生产的多特异性抗体的限制性消化对选择生产多特异性抗体的哺乳动物细胞的用途。

在所有上述方面的一个实施方案中，分析/确定/选择通过使用被消化抗体的质谱结果。

如本文所报告的一个方面是用于确定多特异性抗体中轻链配对的方法，所述方法包括以下步骤：

a)将包含多特异性抗体的样本与蛋白质水解酶孵育限定的时间，

b)通过质谱法鉴定由步骤a)的限制性蛋白水解消化获得的片段的质量，和

c)从步骤b)的结果确定多特异性抗体的轻链配对。

如本文所报告的一个方面是用于确定多特异性抗体的轻链错配的方法，所述方法包括以下步骤：

a)将包含多特异性抗体的样本与蛋白质水解酶孵育限定的时间，