[发明专利]一种西瓜枯萎病菌快速LAMP检测方法

说明书

本发明公开了一种西瓜枯萎病菌快速LAMP检测方法。该方法以尖孢镰刀菌西瓜专化型的特异DNA片段为靶标，设计了一套灵敏、特异的LAMP引物，并结合DNA快速提取方法，建立了西瓜枯萎病菌的快速LAMP检测体系。本LAMP体系对FON‑1基因组DNA的检测下限为10pg/μL，对植物带菌量的检测下限为5×10²孢子/g。本体系从DNA提取到获得检测结果仅需90min左右，且病原菌菌丝和植物组织均可作为检测材料。反应结果肉眼可辨，具有操作简单、特异性强、灵敏度高、稳定性强、应用性广的特点，可为田间西瓜枯萎病菌的快速诊断提供技术支撑。

技术领域

本发明属于西瓜枯萎病菌分子检测技术领域，具体涉及一种西瓜枯萎病菌快速LAMP检测方法。

背景技术

西瓜枯萎病是西瓜(Citrullus lanatus)上的重要病害，在世界范围内均有发生。西瓜枯萎病的病原菌为土传真菌尖孢镰刀菌西瓜专化型，病原菌从植株根部伤口或根毛顶端细胞间侵入植株，逐渐占据并堵塞植株维束管，影响水分输送，导致植株缺水萎蔫，最终枯死。不同尖孢镰刀菌西瓜专化型菌株对不同西瓜品种的致病力有差异，存在生理小种分化。目前已报导的尖孢镰刀菌西瓜专化型生理小种主要有4个，分别为0、1、2和3号生理小种(即FON-0,FON-1,FON-2，FON-3)(3号生理小种在我国自然界中没有)。在我国引起西瓜枯萎病的小种以1号生理小种为主。

环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)，该方法在65℃反应1h就可以完成，且不需要借助PCR仪，有很好的应用前景。目前，西瓜枯萎病菌LAMP检测技术尚未见报道。

发明内容

本发明的目的是首次提供一种西瓜枯萎病菌快速LAMP检测方法。本发明以尖孢镰刀菌西瓜专化型(Fusarium oxysporum f.sp.niveum))特异DNA片段的分析结果为基础，以尖孢镰刀菌西瓜专化型特异DNA片段为靶标设计出一套LAMP引物组，并优化西瓜枯萎病菌DNA提取方法，建立快速检测西瓜枯萎病菌侵染的检测体系。对体系的引物特异性进行检测，并利用该体系对人工接种FON-1的显症和未显症的西瓜植株根部、茎部进行检测，同时采用病菌组织分离法对结果进行检验，以期建立快速、准确、灵敏、适用于田间检测的西瓜枯萎病菌分子检测方法。

本发明的一种西瓜枯萎病菌快速LAMP检测方法，所述的引物是依据西瓜枯萎病菌锚定蛋白3的基因末端和部分非表达序列区域设计而来。

上述序列区域为尖孢镰刀菌西瓜专化型特异片段，依据该片段设计的引物特异性和灵敏度都有显著优势。

所述的检测方法，锚定蛋白3的基因末端和部分非表达序列区域的序列如下：

GTTGCTTACGGTTCTAACTGTGCTACCTGTCGTCAGCGCGCCTAATGCTCGTAAGTCAGGTTCATCGTTTCGAGAGCAACTCCTGCTCATCTGGGGCCACATTCGGTGCGCTAGTTAAGCACCTCTTCGAATCAGTCCTGGATAGTTTGGTGTTCGCTTACTGTTTCGTACTTACACAATCTATCTATCTGGCATGAAATCGCTGACTCCAACTTGTTGAAGCCCACAATTCCTTCCAAGTACCC。见SEQ ID NO.1。

进一步地，采用的引物序列5′→3′：

F3：GTTGCTTACGGTTCTAACTG，见SEQ ID NO.2。

B3：GGGTACTTGGAAGGAATTGTG，见SEQ ID NO.3。

FIP：GATTCGAAGAGGTGCTTAACGTTTCGAGAGCAACTCCTGC，见SEQ ID NO.4。

BIP：AGTCCTGGATAGTTTGGTGCATGCCAGATAGATAGATTG，见SEQ ID NO.5。