[发明专利]一种西瓜枯萎病菌快速LAMP检测方法

权利要求书

1.一种西瓜枯萎病菌快速LAMP检测方法，其特征在于，所述的引物是依据西瓜枯萎病菌锚定蛋白3的基因末端和部分非表达序列区域设计而来，该DNA序列为西瓜枯萎病菌特有。

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述的西瓜枯萎病菌锚定蛋白3的基因末端和部分非表达序列区域的序列如下：

GTTGCTTACGGTTCTAACTGTGCTACCTGTCGTCAGCGCGCCTAATGCTCGTAAGTCAGGTTCATCGTTTCGAGAGCAACTCCTGCTCATCTGGGGCCACATTCGGTGCGCTAGTTAAGCACCTCTTCGAATCAGTCCTGGATAGTTTGGTGTTCGCTTACTGTTTCGTACTTACACAATCTATCTATCTGGCATGAAATCGCTGACTCCAACTTGTTGAAGCCCACAATTCCTTCCAAGTACCC。

3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，采用的引物序列5′→3′：

F3：GTTGCTTACGGTTCTAACTG

B3：GGGTACTTGGAAGGAATTGTG

FIP：GATTCGAAGAGGTGCTTAACGTTTCGAGAGCAACTCCTGC

BIP：AGTCCTGGATAGTTTGGTGCATGCCAGATAGATAGATTG。

4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述的西瓜枯萎病菌为：尖孢镰刀菌西瓜专化型0、1、2号生理小种。

5.根据权利要求1-4任一项所述的检测方法，其特征在于，进行检测时，采用DNA简提法提取DNA。

6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，DNA简提法提取DNA的步骤：取适量待测样品加入30-70μL浓度40-60mmol/L的NaOH溶液的离心管中，沸水浴5-10min；再加入2-8μL pH＝7-8的Tris-HCl缓冲液中和；转速8000-12000r/min离心1-5min；取上清液至新离心管中，-20℃保存备用。

7.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于，

取适量待测样品加入50μL 50mmol/L的NaOH溶液的离心管中，沸水浴10min；再加入5μLpH＝7.5的Tris-HCl缓冲液中和；12000r/min离心5min；取上清液至新离心管中，-20℃保存备用。

8.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于，检测西瓜枯萎病菌时直接取适量待测菌株的菌丝用于提取DNA，检测西瓜植株西瓜枯萎病菌感染时于超净工作台中用蒸馏水将待测西瓜植株组织反复冲洗至干净，灭菌滤纸吸干水分，切下0.05-0.2g的西瓜植株组织，研磨成酱用于提取DNA。

9.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，LAMP反应体系为25μL：12.5μL 2×LAMP反应缓冲液，100μmol/L的外引物FIP和BIP各0.4μL，10μmol/L的内引物F3和B3各0.5μL，6.7μL去离子水，1.0μL Bst DNA聚合酶，2.0μL模板DNA，1.0μL荧光显色剂；

试剂混匀后在恒温水浴锅中65℃反应1h，反应结束后观察产物颜色，产物颜色呈黄绿色的记为阳性，呈橙黄色的记为阴性。