[发明专利]搭载间充质干细胞外泌体的细胞外基质凝胶及其制备方法

说明书

本发明公开了一种搭载间充质干细胞外泌体的细胞外基质凝胶及其制备方法。通过提取间充质干细胞来源的外泌体并混合细胞外基质及甲基丙烯酰化凝胶，使其具有均一性和成形性，并保留间充质干细胞的生物活性，为生物材料组织修复制剂提供新思路。

技术领域

本发明属于生物材料组织修复制剂领域，具体涉及一种搭载间充质干细胞外泌体的细胞外基质凝胶及其制备方法。

背景技术

间充质干细胞外泌体是由间充质干细胞分泌的一类细胞外囊泡，其粒径约60-150nm，通常携带蛋白质、mRNA、miRNA和脂质等生物活性分子，可促进组织细胞生长、分化及组织修复。因此，间充质干细胞外泌体已在组织修复领域获得广泛研究。

细胞外基质是由细胞分泌的多糖、蛋白、蛋白聚糖等生物大分子，组成复杂的结构网络，支持细胞生长并调节细胞的生物行为。细胞外基质已被广泛应用于组织修复领域。

甲基丙烯酰化凝胶(GelMA)是由甲基丙烯酸酐(MA)和明胶(Gelatin)制备获得，是一种光敏性的生物水凝胶，具有十分优异的生物相容性，可由紫外光固化并形成适于细胞生长的三维结构。

目前对于外泌体和生物凝胶的研究通常停留于单独的运用，缺少同时具有外泌体生物活性及生物凝胶支架结构的复合结构化修复材料。申请号为CN108642004A的专利公布了一种外泌体的制备方法及含有外泌体的干细胞增殖试剂，流程化了外泌体制备过程，但仅限于细胞学效果，而未进行支架搭载以实现更佳的组织修复。申请号为CN201811029396.7的专利公布了一种一种脱细胞支架溶液-GelMA水凝胶复合材料及制备方法，但仅限于药物混合，而未实现外泌体之类天然细胞来源的修复材料搭载，使其治疗安全性保障不足。

因此，需要一种搭载间充质干细胞外泌体的细胞外基质凝胶，使其同时具有间充质干细胞的组织修复活性和生物凝胶的组织支撑性。从而达到更好的组织修复效果。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种搭载间充质干细胞外泌体的细胞外基质凝胶及其制备方法。通过提取间充质干细胞来源的外泌体并混合细胞外基质及甲基丙烯酰化凝胶，使其具有均一性和成形性，并保留间充质干细胞的生物活性。

为实现上述目的，本发明提供以下技术方案：将间充质干细胞外泌体与细胞外基质、甲基丙烯酰化凝胶混合，加入0.25％LAP后，经紫外光固化。

作为优选，所述的间充质干细胞外泌体提取方式包括差速离心法、密度梯度离心法、超滤法、沉淀法、免疫分离法、筛分离法。

作为优选，所述细胞外基质包括软骨细胞外基质、骨膜细胞外基质、肌腱细胞外基质。

作为优选，所述的间充质干细胞外泌体提取方式为采用差速离心+超滤法。

作为优选，所述细胞外基质采用软骨细胞外基质。

作为优选，所述细胞外基质、甲基丙烯酰化凝胶混合浓度为细胞外基质1-10％，甲基丙烯酰化凝胶8-15％，单位皆为w/v。

作为优选，细胞外基质浓度为1-3％，甲基丙烯酰化凝胶浓度为10％，单位皆为w/v。

搭载间充质干细胞外泌体的细胞外基质凝胶的制备方法，该方法具体包括以下步骤：

步骤一：当骨髓间充质干细胞融合度达到50-60％时，将其洗涤并在无血清培养基中再培养48小时；

步骤二：收集培养基，通过差速离心法、密度梯度离心法、超滤法、沉淀法、免疫分离法、筛分离法中的多种进行处理；

步骤三：将沉淀用PBS重悬，进行外泌体蛋白定量；

步骤四：将骨膜、软骨或肌腱进行3次反复冻融，并使用1％Triton X-100洗脱24小时；