[发明专利]一种基于CRISPR-Cas12a系统的炭疽芽胞杆菌检测方法

说明书

本发明公开了一种基于CRISPR‑Cas12a系统的炭疽芽胞杆菌检测方法。本发明采用恒温扩增技术，结合CRISPR‑Cas12a蛋白高灵敏度的反式剪切特性，再通过可视化检测，建立了一种可以对炭疽芽孢杆菌快速检测的方法。与之前炭疽杆菌的检测方法相比，本发明具有特异性高，检测时间短，无需电力装置等优点，尤其适用于基层及现场检测。本发明具有重要的应用价值。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种基于CRISPR-Cas12a系统的炭疽芽胞杆菌检测方法。

背景技术

蜡样芽胞杆菌群(包括炭疽芽胞杆菌、蜡样芽胞杆菌和苏云金芽胞杆菌等)菌种之间的基因组同源性较高，差别很小，给炭疽芽胞杆菌的鉴定工作带来很大的困难。炭疽芽胞杆菌的快速检测对于炭疽病的防治以及应对炭疽芽胞生物恐怖袭击等方面都非常重要。目前炭疽芽胞杆菌的核酸检测均需要在实验室内完成，而炭疽病的高发地区通常在卫生经济条件较差的牧区，依赖于荧光定量PCR、测序仪等高精度仪器的检测方法在这些地区推广的成本较高，人员培训难度大。

CRISPR系统最初发现于生物抵抗外来核酸的防御机制，后来被用到生物细胞的基因编辑中。2017年，张锋等应用靶向RNA的CRISPR相关酶(Cas13a)建立了一种快速的、廉价的和高度灵敏的诊断方法(CRISPR-based diagnostic，CRISPR-Dx)(Gootenberg JS,Abudayyeh OO,Lee JW,et al.Nucleic acid detection with CRISPR-Cas13a/C2c2.Science(New York,NY)2017；356:438-42.)。最近，研究人员发现了CRISPR-Cas12a系统对单链DNA的反式剪切活性，展现了巨大的开发空间。

炭疽病发病后，多数采用β内酰胺类和喹诺酮类抗生素(如青霉素和环丙沙星)治疗且预后良好。但是近年来，随着抗生素的应用不当，耐药菌株的数量有不断上升的趋势。研究表明，炭疽芽胞杆菌基因组中的gyrA基因或parC基因发生碱基突变后，表达的蛋白会产生单个氨基酸的变化，这种变化会导致耐环丙沙星菌株的出现。

发明内容

本发明的第一个目的是灵敏、特异且准确的检测炭疽芽胞杆菌。

本发明首先保护检测待测菌是否为炭疽芽胞杆菌的方法，具体可为方法C、方法A或方法B。

所述方法A可包括如下步骤：

(a1)以待测菌的基因组DNA为模板，采用引物对甲进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；

所述引物对甲在炭疽芽胞杆菌基因组上的靶序列含有目标位点；

所述目标位点为plcR位点、CR5位点、lef位点或capB位点；

所述plcR位点如SEQ ID NO:1自5’末端起第219位所示；

所述CR5位点如SEQ ID NO:2自5’末端起第226位所示；

所述lef位点如SEQ ID NO:3自5’末端起第103-119位所示；

所述capB位点如SEQ ID NO:3自5’末端起第182-198位所示；

(a2)完成步骤(a1)后，制备LbCas12a反应体系，进行LbCas12a反应，得到反应产物；该LbCas12a反应体系包括所述PCR扩增产物、探针N12、crRNA和LbCas12a蛋白；

所述探针N12的核苷酸序列如SEQ ID NO:36所示；所述探针N12的一端标记荧光基团，另一端标记猝灭基团；

(a3)完成步骤(a2)后，观察荧光，进行如下判断：

如果具有荧光，则待测菌为炭疽芽胞杆菌或疑似为炭疽芽胞杆菌；