[发明专利]一种基于CRISPR-Cas12a系统的炭疽芽胞杆菌检测方法

权利要求书

1.检测待测菌是否为炭疽芽胞杆菌的方法，为方法C、方法A或方法B；

所述方法C包括如下步骤：

(c1)以待测菌的基因组DNA为模板，采用所述引物对乙进行RPA扩增，得到RPA扩增产物；

(c2)完成步骤(c1)后，制备LbCas12a反应体系，进行LbCas12a反应，得到反应产物；该LbCas12a反应体系包括所述RPA扩增产物、探针ProbeFITCbio、crRNA和LbCas12a蛋白；

所述探针ProbeFITCbio的核苷酸序列如SEQ ID NO:37所示；所述探针ProbeFITCbio一端标记FITC，另一端标记BIO；

(c3)完成步骤(c2)后，用HybriDetectDipsticks试纸条检测反应产物，进行如下判断：

如果质控带清晰且检测带清晰，则待测菌为炭疽芽胞杆菌或疑似为炭疽芽胞杆菌；

如果质控带清晰且检测带不清晰，则待测菌不为炭疽芽胞杆菌或疑似不为炭疽芽胞杆菌；

所述方法A包括如下步骤：

(a1)以待测菌的基因组DNA为模板，采用引物对甲进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；

所述引物对甲在炭疽芽胞杆菌基因组上的靶序列含有目标位点；

所述目标位点为plcR位点、CR5位点、lef位点或capB位点；

所述plcR位点如SEQ ID NO:1自5’末端起第219位所示；

所述CR5位点如SEQ ID NO:2自5’末端起第226位所示；

所述lef位点如SEQ ID NO:3自5’末端起第103-119位所示；

所述capB位点如SEQ ID NO:3自5’末端起第182-198位所示；

(a2)完成步骤(a1)后，制备LbCas12a反应体系，进行LbCas12a反应，得到反应产物；该LbCas12a反应体系包括所述PCR扩增产物、探针N12、crRNA和LbCas12a蛋白；

所述探针N12的核苷酸序列如SEQ ID NO:36所示；所述探针N12的一端标记荧光基团，另一端标记猝灭基团；

(a3)完成步骤(a2)后，观察荧光，进行如下判断：

如果具有荧光，则待测菌为炭疽芽胞杆菌或疑似为炭疽芽胞杆菌；

如果不具有荧光，则待测菌不为炭疽芽胞杆菌或疑似不为炭疽芽胞杆菌；

所述方法B包括如下步骤：

(b1)以待测菌的基因组DNA为模板，采用引物对乙进行RPA扩增，得到RPA扩增产物；

所述引物对乙在炭疽芽胞杆菌基因组上的靶序列含有所述plcR位点、所述CR5位点、所述lef位点或所述capB位点；

(b2)完成步骤(b1)后，制备LbCas12a反应体系，进行LbCas12a反应，得到反应产物；该LbCas12a反应体系包括所述RPA扩增产物、所述探针N12、crRNA和LbCas12a蛋白；

(b3)完成步骤(b2)后，观察荧光，进行如下判断：

如果具有荧光，则待测菌为炭疽芽胞杆菌或疑似为炭疽芽胞杆菌；

如果不具有荧光，则待测菌不为炭疽芽胞杆菌或疑似不为炭疽芽胞杆菌；

所述方法用于非疾病的诊断与治疗。