[发明专利]一种基于CRISPR-Cas系统可视化检测炭疽芽胞杆菌及其耐药性的方法

说明书

本发明公开了一种基于CRISPR‑Cas系统可视化检测炭疽芽胞杆菌及其耐药性的方法。该方法将DNAzyme中ssDNA设计成探针，结合CRISPR‑Cas12a系统对单链DNA的反式剪切活性，完成了对炭疽芽胞杆菌的鉴定和耐药基因的检测，检测结果可以根据反应液颜色变化来判断，方法简单便携，非常适合现场及临床标本的快速检测。本发明具有重要的应用价值。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种基于CRISPR-Cas系统可视化检测炭疽芽胞杆菌及其耐药性的方法。

背景技术

在一些情况下，需要现场部署的检测方法来筛选标本，检测炭疽芽胞杆菌的存在。传统的检测方法(如微生物学、免疫学、分子生物学)虽然达到了很高的灵敏度和特 异性，但都需要特殊的仪器设备，不符合简单便携的现场检测要求。目前一般利用 Cas12a的切割活性，直接切割DNAzyme(即G四链体)：如果crRNA与靶序列配对成功， 则激活Cas12a切割活性，降解DNAzyme，溶液呈现无色状态(阳性结果)；如果crRNA 不能与靶序列配对，则Cas12a不具有切割活性，DNAzyme形成四链体，溶液呈现绿色 (阴性结果)。实验证明，该方法在检测中具有很高的假阳性，特别是对于SNP位点的 检测。原因可能是核酶的显色受缓冲液影响较大，缓冲液中的金属离子等会非特异的 抑制DNAzyme的活性。为了实现灵敏、特异、准确并且简单便携的检测目标，需要建 立一种新的方法鉴定炭疽芽胞杆菌。

研究发现，有一类特殊的寡核苷酸，与高铁血红素(Hemin)结合后具有过氧化物酶活性，在H₂O₂存在下能够催化无色的ABTS底物显出绿色。这类ssDNA富含鸟嘌呤， 能够聚集成G-四联体结构，与Hemin结合可以发挥过氧化物酶活性。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种灵敏、特异且准确的检测炭疽芽胞杆菌的新方法。

本发明保护一种可视化检测炭疽芽胞杆菌的方法，可包括如下步骤：

(1)以待测菌的基因组DNA为模板，采用引物对进行RPA扩增，得到RPA扩增产 物；

所述引物对在炭疽芽胞杆菌基因组上的靶序列含有目标位点；

所述目标位点可为plcR位点、lef位点、capB位点或CR5位点；

所述plcR位点可如SEQ ID NO:1自5’末端起第219位所示；

所述lef位点可如SEQ ID NO:2自5’末端起第103-119位所示；

所述capB位点可如SEQ ID NO:3自5’末端起第182-198位所示；

所述CR5位点可如SEQ ID NO:1自5’末端起第226位所示；

(2)完成步骤(1)后，制备LbCas12a反应体系，进行LbCas12a反应，得到反 应产物；LbCas12a反应体系包括所述RPA扩增产物、探针ProbeCatG4R、crRNA和LbCas12a蛋白；

所述探针ProbeCatG4R的核苷酸序列如SEQ ID NO:28所示；

(3)完成步骤(2)后，向反应产物中加入探针ProbeCatG4，变性；之后加入Hemin，反应；最后加入ABTS和H₂O₂；

所述探针ProbeCatG4的核苷酸序列如SEQ ID NO:27所示；

(4)完成步骤(3)后，观察颜色，进行如下判断：

如果反应体系的颜色为绿色，则待测菌为炭疽芽胞杆菌或疑似为炭疽芽胞杆菌；

如果反应体系的颜色为无色，则待测菌不为炭疽芽胞杆菌或疑似不为炭疽芽胞杆菌；