[发明专利]一种基于CRISPR-Cas系统可视化检测炭疽芽胞杆菌及其耐药性的方法有效
| 申请号： | 202110515707.6 | 申请日： | 2021-05-12 |
| 公开（公告）号： | CN113444816B | 公开（公告）日： | 2022-08-02 |
| 发明（设计）人： | 王东澍;吕宇飞;王恒樑;刘先凯;陈刚;冯尔玲 | 申请（专利权）人： | 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 |
| 主分类号： | C12Q1/689 | 分类号： | C12Q1/689;C12Q1/6844;C12Q1/04;C12N15/11;C12R1/07 |
| 代理公司： | 北京纪凯知识产权代理有限公司 11245 | 代理人： | 闫书宁 |
| 地址： | 100850 *** | 国省代码： | 北京;11 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 基于 crispr cas 系统 可视化 检测 炭疽 杆菌 及其 耐药性 方法 | ||
1.一种可视化检测炭疽芽胞杆菌的方法，包括如下步骤：
(1)以待测菌的基因组DNA为模板，采用引物对进行RPA扩增，得到RPA扩增产物；
所述引物对在炭疽芽胞杆菌基因组上的靶序列含有目标位点；
所述目标位点为plcR位点、lef位点、capB位点或CR5位点；
所述plcR位点如SEQ ID NO:1自5’末端起第219位所示；
所述lef位点如SEQ ID NO:2自5’末端起第103-119位所示；
所述capB位点如SEQ ID NO:3自5’末端起第182-198位所示；
所述CR5位点如SEQ ID NO:1自5’末端起第226位所示；
(2)完成步骤(1)后，制备LbCas12a反应体系，进行LbCas12a反应，得到反应产物；LbCas12a反应体系包括所述RPA扩增产物、探针ProbeCatG4R、crRNA和LbCas12a蛋白；
所述探针ProbeCatG4R的核苷酸序列如SEQ ID NO:28所示；
(3)完成步骤(2)后，向反应产物中加入探针ProbeCatG4，变性；之后加入Hemin，反应；最后加入ABTS和H2O2；
所述探针ProbeCatG4的核苷酸序列如SEQ ID NO:27所示；
(4)完成步骤(3)后，观察颜色，进行如下判断：
如果反应体系的颜色为绿色，则待测菌为炭疽芽胞杆菌或疑似为炭疽芽胞杆菌；
如果反应体系的颜色为无色，则待测菌不为炭疽芽胞杆菌或疑似不为炭疽芽胞杆菌；
所述方法用于非疾病的诊断与治疗。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述引物对为引物对1，其在炭疽芽胞杆菌基因组上的靶序列含有plcR位点；此时crRNA为crRNA1；
所述引物对1由引物1和引物2组成；引物1的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示；引物2的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示；crRNA1的核苷酸序列如SEQ ID NO:21所示。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述引物对为引物对2，其在炭疽芽胞杆菌基因组上的靶序列含有lef位点；此时crRNA为crRNA2；
所述引物对2由引物3和引物4组成；引物3的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示；引物4的核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示；crRNA2的核苷酸序列如SEQ ID NO:22所示。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述引物对为引物对3，其在炭疽芽胞杆菌基因组上的靶序列含有capB位点；此时crRNA为crRNA3；
所述引物对3由引物5和引物6组成；引物5的核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示；引物6的核苷酸序列如SEQ ID NO:12所示；crRNA3的核苷酸序列如SEQ ID NO:23所示。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述引物对为引物对4，其在炭疽芽胞杆菌基因组上的靶序列含有CR5位点；此时crRNA为crRNA4；
所述引物对4由引物7和引物8组成；引物7的核苷酸序列如SEQ ID NO:13所示；引物8的核苷酸序列如SEQ ID NO:14所示；crRNA4的核苷酸序列如SEQ ID NO:24所示。
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