[发明专利]一种表达A型塞内卡病毒结构蛋白的方法

说明书

本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及一种高效表达A型塞内卡病毒结构蛋白的方法。本发明首先对编码A型塞内卡病毒三种结构蛋白VP0、VP3和VP1的基因进行原核表达密码子优化，并借助小泛素样融合蛋白，获得了在大肠杆菌中同时可溶性表达三种结构蛋白的单个质粒；其次，在大肠杆菌中转入分子伴侣质粒和上述A型塞内卡病毒结构蛋白质粒，进一步提高了A型塞内卡病毒结构蛋白的可溶性表达，并解决了目标蛋白表达量不均一的问题，获得的目标蛋白约占菌体总蛋白25％以上；由表达获得的三种结构蛋白配制获得的塞内卡病毒病亚单位疫苗，能够激发猪体产生较高水平的中和性抗体，对国内A型塞内卡流行毒具有良好的保护作用。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种高效表达A型塞内卡病毒结构蛋白的方法。

背景技术

A型塞内卡病毒(Senecavirus A，SVA)也称塞内卡病毒(Seneca Valleyvirus，SVV)，属于小RNA病毒科、塞内卡病毒属，其基因组为单链正股RNA，基因组长度约为7.2kb。SVA唯一的开放阅读框(ORF)用于编码多聚前体蛋白，具有小RNA病毒典型的L-4-3-4结构，包含L前体蛋白及结构蛋白的P1区和非结构蛋白的P2区和P3区，P1区蛋白在病毒2A、3C蛋白酶和宿主蛋白酶水解下可产生3种结构蛋白和7种非结构蛋白。VP0、VP1和VP 3作为病毒衣壳的表面结构蛋白具有良好的免疫原性。

SVA最初被认为是细胞培养过程的污染物，推测其来源于猪的胰酶或胎牛血清。2007年SVA被发现是引起加拿大发生的猪原发性水疱病(PIVD)的致病病原，SVA感染猪后引起鼻吻部、蹄部冠状带出现明显水泡，同时伴有跛行、厌食、嗜睡和发烧等临床症状，与口蹄疫症状无法区分，困扰口蹄疫防控，严重危害养猪业发展。尽快研发疫苗成为防控该病大范围流行最迫切、有效的方法。

塞内卡灭活疫苗是塞内卡田间毒株经病毒培养系统大量扩增、灭活、乳化等工艺制成，具有良好的免疫保护效果。但是，传统的灭活疫苗在生产制备过程中存在因病毒灭活不彻底而散毒的风险、生产成本较高等问题，亟需研制更加安全、有效的新型塞内卡病毒疫苗。

塞内卡病毒结构蛋白负责组装病毒衣壳，决定抗原特异性，是病毒重要的抗原成份。与小RNA病毒科的其它病毒相似，塞内卡病毒三种结构蛋白VP0、VP3和VP1在体外混合后，一部分会自行装配形成空衣壳(病毒样颗粒)，其形态、结构与真实病毒粒子相同或相似，保有病毒粒子空间构象，但不含病毒核酸，无法进行复制，也不具有感染性。塞内卡病毒空衣壳含有病毒的特异性抗原表位，能模拟天然病毒被宿主抗原提呈细胞的识别过程，有效刺激机体产生很强的免疫应答，是更加安全有效的疫苗候选者。但是，相较于其他小RNA病毒科病毒(口蹄疫病毒)的病毒空衣壳，提高塞内卡病毒空衣壳的产率和纯度相对比较困难，即使采用制备其他小RNA病毒科病毒(口蹄疫病毒)空衣壳的相同体系，仍然无法提高塞内卡病毒空衣壳的产率和纯度。

目前通过基因工程技术，利用大肠杆菌表达系统制备塞内卡病毒空衣壳已有文献报道。大肠杆菌表达系统具有成本低、细胞生长快、可规模放大等特点，但其表达产物易形成包涵体，导致生物活性较差，而获得的目的蛋白的纯度较低。因此提高SVA结构蛋白的表达纯化量十分必要。有研究表明，在大肠杆菌表达系统中，通过将不同融合标签结合使用，可以提高目的蛋白的表达量和病毒样颗粒的组装效率，例如专利(CN108642021B)公开了在A型塞内卡病毒结构蛋白VP0、VP1、VP3中引入SUMO，分别构建了VP0、VP1、VP3的表达质粒，并在SUMO VP1基因的N端再次融合GST得VP1重组载体，并与VP0和VP3的表达质粒共同转染的表达菌表达。但是分别构建多个表达质粒、借助多种融合蛋白、通过多种抗性筛选工程菌株步骤较为复杂。也有研究表明分子伴侣能够提高目的蛋白的可溶性表达，例如文献(A型口蹄疫结构蛋白VP1可溶性表达及O型口蹄疫结构蛋白的融合表达[D]，崔颖磊)公开了使用分子伴侣促进A型口蹄疫结构蛋白VP1可溶性表达的策略，但是分子伴侣促进目的蛋白可溶性表达的结果也存在一定的随机性，相反可能会抑制其他酶或蛋白的可溶性表达；而且在蛋白纯化过程中分子伴侣污染现象严重。

发明内容