[发明专利]协同靶向肝脏递送LDLR的重组基因集、载体组、外泌体及构建方法和应用

说明书

本发明涉及基因工程领域，特别是涉及协同靶向肝脏递送LDLR的重组基因集、载体组、外泌体及构建方法和应用。本发明提供了协同靶向肝脏递送LDLR的重组基因集，所述重组基因集包括第一重组基因和第二重组基因；所述第一重组基因从5’端至3’端包括依次连接的IRES片段、LDLR片段和MS2片段；所述第二重组基因从5’端至3’端包括依次连接的kozak片段、CD63第一片段、Apoa1片段、CD63第二片段和MCP片段。本发明所述重组基因集肝脏靶向能力显著提高，具有高效装载核酸药物和脱靶率低的优势，同时还能够有效治疗高脂血症和动脉粥样硬化。

技术领域

本发明涉及基因工程领域，特别是涉及协同靶向肝脏递送LDLR的重组基因集、载体组、外泌体及构建方法和应用。

背景技术

家族性高胆固醇血症(FH)是一种由低密度脂蛋白(LDL)受体基因突变引起的常染色体显性遗传病，生化指标上表现为血浆总胆固醇和LDL胆固醇水平极度升高，临床表现为黄色瘤和早发冠心病等。对于杂合子型，患者1条同源基因存在突变，只能产生一半具有正常结构和功能的受体，其血浆胆固醇升高会随着年龄的增长，逐渐显现出来。对于这种杂合子型能通过药物刺激LDL受体的表达，从而使血浆LDL水平下降。但对于纯合子型，该基因2条同源染色体均存在突变，表达为功能缺陷的LDLR，尚无确切有效的治疗方法。

由于仅用药物治疗难以达到治疗的目的，且目前采用的治疗方法(血浆置换和肝移植)又很不理想，故这些患者极易早发动脉粥样硬化性疾病，造成患者较早的死亡。

肝脏是人体合成胆固醇、组装和运输脂蛋白的重要场所，在脂代谢过程中发挥关键作用；其次，肝脏是降解低密度脂蛋白的主要器官，约50％的LDL在肝降解；更重要的是肝脏是唯一能够将胆固醇分泌到体外的器官，对维持体内胆固醇的生理水平、胆固醇代谢起着重要的作用。因此，从靶向肝脏着手寻找一种有效治疗高脂血症和动脉粥样硬化的方法是非常必要的。

多年来，为了实现靶向肝脏纠正异常的LDL受体，科学家们先后尝试了有逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺病毒相关病毒载体、慢病毒载体及诱导性多潜能干细胞等应用于家族性高胆固醇血症的基因治疗，但由于安全性等问题，这些研究大多还停留在动物实验中，极少进入临床研究阶段。

外泌体作为蛋白和核酸药物良好的载体，目前利用外泌体递送核酸用于基因治疗仍存在几个瓶颈问题：1)天然的外泌体靶向能力较弱，这会导致为满足治疗效果增加外泌体的注射剂量，因此，外泌体的靶向性需要提高；2)如何高效装载目的RNA至外泌体，以提升外泌体效能，尚缺乏有效手段；3)脱靶问题将制约外泌体递送向临床转化，如何实现外泌体携带的药物具有组织特异性需要进一步探索。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了协同靶向肝脏递送LDLR的重组基因集、载体组、外泌体及构建方法和应用。本发明所述重组基因集肝脏靶向能力显著提高，具有高效装载核酸药物和脱靶率低的优势，同时还能够有效治疗高脂血症和动脉粥样硬化。

为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

本发明提供了协同靶向肝脏的重组基因集，所述重组基因集包括第一重组基因和第二重组基因；所述第一重组基因从5’端至3’端包括依次连接的IRES片段、LDLR片段和MS2片段；所述第二重组基因从5’端至3’端包括依次连接的kozak片段、CD63第一片段、Apoa1片段、CD63第二片段和MCP片段。

优选的，所述IRES片段的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；所述LDLR片段的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；所述MS2片段的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示；所述kozak片段的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示；所述CD63第一片段的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示；所述Apoa1片段的核苷酸序列如SEQ ID No.8所示；所述CD63第二片段的核苷酸序列如SEQID No.9所示；所述MCP片段的核苷酸序列如SEQ ID No.10所示。