[发明专利]无质粒、无诱导剂使用的产D-泛酸基因工程菌及构建方法

说明书

本发明涉及一种高产D‑泛酸的基因工程菌、构建方法，及其在微生物发酵制备D‑泛酸中的应用。本发明通过对大肠杆菌的有机酸合成途径相关基因进行了阻断，减少有机酸的副作用及增加丙酮酸池的积累，加强丙酮酸合成途径基因pykA，加强丙酮酸积累，解除关键酶的负反馈抑制，解决D‑泛酸合成的瓶颈步骤，改善糖摄取能力，增加了前体丙酮酸的积累，过表达基因lpd、ilvD改善主路合成途径基因的表达情况，最终获得更高产D‑泛酸工程菌，无需质粒引入外源酶增强关键酶酶活，摇瓶发酵产量达到3.99g/L；敲除阻遏蛋白编码基因lacI后形成组成型表达，并进行培养基优化后，摇瓶发酵产量达到4.72g/L；在5L发酵罐中分批补料发酵，产量达到34.28g/L。

(一)技术领域

本发明属于代谢工程领域，具体涉及无质粒、无诱导剂使用的高产D-泛酸基因工程菌及其构建方法和应用。

(二)背景技术

泛酸属于维生素B族，又称维生素B5，是一种水溶性维生素，存在D型和L型两种构型，但仅D-型(D-PA)具有生物活性。泛酸在生物体内可作为辅酶A(CoA)的前体，在几乎所有的生物过程中发挥关键作用，推动生物体内的能源代谢和能量交换。泛酸的磷酸化产物巯基乙胺可以合成4-磷酸泛酰巯基乙胺，为辅酶A(CoA)及酰基载体蛋白(ACP)的组成部分，而CoA及ACP构成酰基转移酶的辅酶，广泛参与糖、脂类、蛋白质代谢及肝脏的生物转化作用，对生物体的生长起到显著的促进作用，但目前发现泛酸只能由植物和微生物合成。动物不能合成泛酸，需要从外界摄取，因此泛酸广泛地应用于食品工业、化妆品以及食品添加剂和饲料添加剂，具有良好的市场价值。

目前，D-泛酸的生产方法包括物理诱导结晶法、拆分法以及微生物法，其中微生物法又包含代谢工程法、发酵法和生物酶法。鉴于绿色发展的兴起与需要，物理诱导结晶法、拆分法存在毒性和环境污染、拆分试剂贵的问题，亟需对此方法做出转变，随着生物技术的不断深入研究，许多化学产品可以通过生物法生产。对于D-泛酸的生物生产，现在生物酶法虽然取得较大进步，但依然需要昂贵的前体，是不经济的，而发酵法缺乏合适的菌株，故通过代谢工程的方法构建一株高产D-泛酸的生产菌株。

工业上常用的生产宿主菌株包括大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌，但是谷氨酸棒杆菌因工程改造较为复杂、周期较长，菌株改进难度大。目前利用谷氨酸棒杆菌生产D-泛酸产量尚不足 2g/L，不利于工业化生产D-泛酸。大肠杆菌是另一种常用的氨基酸生产菌，大肠杆菌具有遗传背景清晰，操作简便等优点。

在大肠杆菌中，泛酸是由β-丙氨酸及泛解酸合成的，分别由β-丙氨酸代谢、泛解酸代谢以及泛酸合成三部分组成。β-丙氨酸是由天门冬氨酸-α-脱羧酶(L-aspartate-alpha-decarboxylase) 立体特异性地脱去L-Asp的α位羧基而成，同时释放CO2；泛解酸代谢途径中，来源于直接前体-丙酮酸，首先在乙酰乳酸合酶、乙酰乳酸异构还原酶、2-羟基脱水酶作用形成α-酮异戊酸，然后α-酮异戊酸在羟甲基转移酶(ketopantoatehydroxymethyltransferase，KPHMT)作用下生成酮泛解酸，后者在酮泛解酸还原酶作用下还原生成泛解酸。最后β-丙氨酸和泛解酸在泛酸合成酶(pantothenate synthetase，PS)的作用下合成泛酸。