[发明专利]无质粒、无诱导剂使用的产D-泛酸基因工程菌及构建方法有效

专利信息
申请号: 202110512009.0 申请日: 2021-05-11
公开(公告)号: CN113278569B 公开(公告)日: 2022-04-19
发明(设计)人: 柳志强;张博;陈力;金洁漪;李波;王培;郑裕国 申请(专利权)人: 浙江工业大学
主分类号: C12N1/21 分类号: C12N1/21;C12N15/53;C12N15/54;C12N15/31;C12N15/113;C12P13/02;C12R1/19
代理公司: 浙江千克知识产权代理有限公司 33246 代理人: 冷红梅
地址: 310014 浙*** 国省代码: 浙江;33
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摘要:
搜索关键词: 质粒 诱导剂 使用 泛酸 基因工程 构建 方法
【权利要求书】:

1.一种高产D-泛酸的基因工程菌,由如下方法构建获得:

(1)以E. coli DPA8为底盘菌,将其基因组中的poxB基因敲除,得到重组菌株DPA8 △poxB,记为DPA8-1;

(2)敲除菌株DPA8 △poxB中的pta基因,得到重组菌株DPA8△poxB/pta,记为DPA8-2;

(3)将菌株DPA8△poxB/pta基因组中ldhA基因敲除,得到重组菌株DPA8△poxB/pta/ldhA,记为DPA8-3;

(4)将菌株DPA8△poxB/pta/ldhA基因组中plfB基因敲除,得到重组菌株DPA8△poxB/pta/ldhAplfB,记为DPAN9;

(5)将菌株DPA8△poxB/△pta/△ldhAplfB基因组中的pykA基因的启动子替换为Trc启动子,得到DPA8△poxB/pta/ldhAplfB/ Trc-pykA,记为DPAN10;

(6)将菌株DPA8△poxB/pta/ldhAplfB/ Trc-pykA基因组中的ilvN基因用ilvN突变基因(G59A+C60T+T62A+A63C+A64T+G66C)替换,得到重组菌株DPA8△poxB/pta/ldhAplfB/ Trc-pykA/ilvN*,记为DPAN10-1;

(7)菌株DPA8△poxB/pta/ldhAplfB/ Trc-pykA/ilvN*基因组中的ilvH基因用ilvH突变基因(G41A+C50T)替换,得到重组菌株DPA8△poxB/pta/ldhAplfB/ Trc-pykA/ilvN*/ilvH*,记为DPAN10-2或者DPAN11;

(8)将菌株DPA8△poxB/pta/ldhAplfB/ Trc-pykA/ Trc-pykF/ilvN*/ilvH*基因组中的spoT基因用spoT突变基因(C868G+G869A+C870A+A874G+A876T)替换并使用trc启动子替换原生启动子,得到重组菌株DPA8△poxB/pta/ldhAplfB/ Trc-pykA//ilvN*/ilvH*/Trc-spoT*,记为DPAN12;

(9)将菌株DPA8△poxB/pta/ldhAplfB/ Trc-pykA/ Trc-pykF/ilvN*/ilvH*/Trc-spoT*基因组中的lpd基因的启动子替换为Trc启动子,得到重组菌株DPA8△poxB/pta/ldhAplfB/ Trc-pykA/ilvN*/ilvH*/Trc-spoT*/Trc-lpd,记为DPAN13;

(10)将菌株DPA8△poxB/pta/ldhA△plfB/ Trc-pykA/ilvN*/ilvH*/trc-spoT*/trc-lpd基因组中的ilvD基因的启动子替换为Trc启动子,得到重组菌株DPA8△poxB/pta/ldhAplfB/ Trc-pykA/ilvN*/ilvH*/Trc-spoT*/Trc-lpd/Trc-ilvD,记为DPAN14;

(11)将菌株DPA8△poxB/pta/ldhAplfB/Trc-pykA/ilvN*/ilvH*/trc-spoT*/Trc-lpd/Trc-ilvD基因组中的lacI基因敲除,得到重组菌株DPA8△poxB/pta/ldhAplfB/Trc-pykA/ilvN*/ilvH*/Trc-spoT*/Trc-lpd/Trc-ilvD/lacI,记为DPAN15,即所述高产D-泛酸的基因工程菌。

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