[发明专利]RXR酵母转录激活系统及其加标沉积物毒理实验方法

说明书

RXR酵母转录激活系统及其加标沉积物毒理实验方法，包括将栉孔扇贝维甲酸受体基因RXRa分别连接到载体pGBT9和pGADT7上，分别构建pGBT9‑RXRa和pGADT7‑RXRa酵母表达质粒，将pGBT9‑RXRa及pGADT7‑RXRa共转化入Y187酵母细胞构建RXRa/RXRa二聚体酵母转录激活系统，筛选培养阳性克隆。制备有机锡加标沉积物模拟真实环境中有机锡污染样品，通过构建的酵母转录激活系统检测有机锡加标沉积物对栉孔扇贝RXR二聚体的诱导效应，操作简单便捷，为有机锡类污染物的新型检测技术开发提供了可能，为加标沉积物毒理实验提供了新的实验思路。

技术领域

本发明涉及一种RXR酵母转录激活系统及其加标沉积物毒理实验方法，具体是通过构建重组质粒获得包含RXR二聚体的酵母转录激活系统，以及利用制备的加标沉积物检测此系统转录激活效应。

背景技术

环境中的许多内分泌干扰物(EDCs)通过大气沉降、城市与农业径流以及工业废水等途径进入水环境，有相当一部分污染物会吸附在悬浮颗粒物表面，最后附着在沉积物上，长时间连续沉降过程将污染物积聚在上部沉积物表层，从而使其成为二次扩散的潜在污染源。水生生物通过与亲脂性EDCs物理性接触或直接摄食这些颗粒物等途径暴露于污染环境中，因此，沉积物对营滤食性及底栖生活的软体动物产生长期的威胁，影响水体生态系统的稳态平衡。

沉积物加标毒理实验是一种基于沉积物中污染物浓度与生物效应之间关系的方法。其实质是向清洁的沉积物中加入已知数量的特定污染物，建立污染物与受试生物之间的剂量效应关系，以此来预测沉积物中污染物对生物的危害，并达到监测和科学管理沉积物污染的目的。OECD已经针对摇蚊幼虫(Chironomus tentans)与端足类淡水虾(Hyalellaazteca)等生物建立起沉积物加标测试标准，但常受生物繁殖与实验需时长等因素的影响，相比单细胞生物试验更费时费力。真核微生物如原生动物和微真菌为沉积物中第一营养级，为包括污染物在内的各种有机化合物提供营养，因此，它们可以作为评价水生系统生态毒性的有利指示生物。除了广泛使用的梨形四膜虫(Tetrahymena pyriformis)之外，酿酒酵母作为研究背景清晰的单细胞真核生物，是基础生物学研究的优秀模型，也是环境水体或沉积物中外源物质毒性测试的重要生物工具，适合对污染物及污水的生态毒性进行生物测试。

发明内容

本发明的目的在于RXR酵母转录激活系统及其加标沉积物毒理实验方法，能够较为灵敏的检测沉积物中有机锡等污染物对RXR二聚体的干扰效应，操作简便，以克服现有技术的缺点与不足。

本发明通过以下技术方案实现：

一种RXR酵母转录激活系统，该系统含有pGBT9-RXRa酵母表达质粒和pGADT7-RXRa酵母表达质粒；所用宿主细胞为酿酒酵母Y187菌株；

所述两种酵母表达质粒所用载体分别为pGBT9与pGADT7，其中，pGBT9载体含有GAL4因子的DNA结合结构域(DNA-BD)以及营养缺陷型筛选标记Trp，pGADT7载体含有GAL4因子的激活结构域(AD)以及营养缺陷型筛选标记Leu。

其中，所述的pGBT9-RXRa和pGADT7-RXRa酵母表达质粒均融合了序列为SEQ IDNo.1的栉孔扇贝维甲酸X受体基因RXRa。

一种RXR酵母转录激活系统的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)酵母表达质粒pGBT9-RXRa的构建

利用Primer Premier 5.0软件设计受体基因RXRa的特异性引物，在引物两端添加特异性酶切位点及与载体pGBT9同源的15-20个核苷酸序列；

利用上述引物扩增靶基因保守区域片段：利用栉孔扇贝性腺组织cDNA模板及高保真酶进行PCR反应，胶回收纯化获得RXRa的目的插入片段；