[发明专利]一种多酶级联制备对香豆酸的方法

说明书

本发明提供了一种多酶级联催化合成对香豆酸的方法。以对羟基苯丙酮酸为原料，经过羰基还原酶还原为对羟基苯基乳酸，然后通过脱水酶制备对香豆酸。本方法可以在管式反应器‑膜分离耦合装置中进行连续化生产，也可以在间歇反应釜法，羰基还原酶所需要的辅酶NAD(P)H通过葡萄糖脱氢酶和葡萄糖反应再生。每批羰基还原酶、葡萄糖脱氢酶、脱水酶均可回收利用5次以上，生产效率最高可达到50 g/L.h。本发明生产成本低、效率高、产品纯度好。

技术领域

本发明涉及酶催化领域；更具体地说，是涉及一种多酶级联催化合成对香豆酸的方法。

背景技术

对香豆酸(4-羟基肉桂酸或反式4-香豆酸，p-Coumaric acid，p-CA)，广泛存在于植物中，是白花蛇舌草、杜仲叶等植物的有效成分，具有预防心血管疾病、抗氧化等生物活性，是合成类黄酮、异黄酮、芪类等高价值保健品的中间体，如柚皮素、花青素、槲皮素、儿茶素、白藜芦醇、羟基酪醇和咖啡酸等；在农业行业用于植物生长促进剂；在食品行业用于长效杀菌剂和果蔬保鲜防腐剂。在化妆品行业由于对香豆酸对酪氨酸单酚酶和二酚酶均有抑制作用，所以添加到化妆品里抑制黑色素的生成。

同时它也是重要的精细化工原料。通过降解反应生成对羟基苯甲酸；对香豆酸还可作为祛痰药杜鹃素、抗肾上腺素药物艾司洛尔等物质合成的中间体，还可以用于临床上治疗轻、中度老年痴呆的药物-加烂他敏的合成。因此寻找高效、绿色的对香豆酸及其衍生物制备方法已经成为国内外研究热点。

目前，对香豆酸的制备主要有植物提取、化学合成和生物合成3种方法。其中植物提取存在植物生长周期长、收集半径大、萃取效率低等问题；化学合成则面临能耗高、反应时间长及环境污染等问题；而生物合成则具有低成本、高产率和绿色环保等优势，被认为是最有前景的生产方法。

在生物合成方法中有酶催化法和从头合成法两种。

其中，酶催化的专利有：(1)“一种酶催化法合成反式-4-香豆酸的方法”，专利申请号为201911167675.4，该专利申请是以肉桂酸为原料，利用反式-肉桂酸-4-单加氧酶(EC1.14.14.91)进行催化合成，添加了还原型辅酶供体，价格十分昂贵，底物浓度可以达到100g/L，收率未报到。(2)“一种反式肉桂酸-4-羟基化酶及其编码基因与应用”，专利号为：201710136604，该发明利用石蒜属植物忽地笑的反式肉桂酸-4-羟化酶进行催化合成，该途径所有的羟化酶也是属于植物细胞色素P450酶EC1.14.14.91，但其产率仅为0.4g/L。

微生物从头合成法：专利号为：201510411910，名称为“一种酵母菌的用途及天然对香豆酸的生产方法”公开了利用酵母细胞发酵发生产反式-4-香豆酸，产量可达10g/L左右。也有期刊文献报道利用酿酒酵母生物合成法对香豆酸的，合成产量仅仅达1.9g/L。

上述方法均存在产率不高、酶源单一、制备成本高等问题。

发明内容

本发明提供一种多酶级联制备对香豆酸的方法，本发明方法与上述方法均不同，以对羟基苯丙酮酸为原料，采用羰基还原酶、葡萄糖脱氢酶和脱水酶3种体外酶多酶级联耦合的方法，在管式反应器或间歇反应器中催化合成对香豆酸，反应体系简单，酶可以回收利用，辅酶可以原位再生，大大降低成本，提高产率。

本发明的技术方案是，一种多酶级联制备对香豆酸的方法，以对羟基苯丙酮酸为原料，经过羰基还原酶还原为对羟基苯基乳酸，再通过脱水酶制备得到对香豆酸。

进一步地，所述羰基还原酶还原过程中需要辅酶NAD(P)H，其采用葡萄糖脱氢酶和葡萄糖反应再生。

更进一步地，该方法在管式反应器-膜分离耦合装置中进行连续化生产，即经过一级管式反应、一级超滤酶回收系统、二级管式反应和二级超滤酶回收系统实现连续化生产；或采用一个管式反应器或一个间歇反应釜，分步添加不同的酶实现对香豆酸的间歇化生产。

再进一步地，该制备方法的具体步骤为：