[发明专利]一种多酶级联制备对香豆酸的方法

权利要求书

1.一种多酶级联制备对香豆酸的方法，其特征在于：以对羟基苯丙酮酸为原料，经过羰基还原酶还原为对羟基苯基乳酸，再通过脱水酶制备得到对香豆酸；其中羰基还原酶为近平滑假丝酵母ATCC7330的羰基还原酶，利用重组菌 E.coliBL21（DE3）/ pACYCDuet-1-cpcr均质破碎制得羰基还原酶还原过程中需要辅酶NAD(P)H，其采用葡萄糖脱氢酶和葡萄糖反应再生；所述脱水酶为产胞芽孢杆菌Clostridium sporogenes的液体酶制剂的脱水酶，酶活为3000U/L, 脱水酶液体酶制剂的添加量为对羟基苯基乳酸底物的质量的1-5%。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：该方法在管式反应器-膜分离耦合装置中进行连续化生产，即经过一级管式反应、一级超滤酶回收系统、二级管式反应和二级超滤酶回收系统实现连续化生产；或采用一个管式反应器或一个间歇反应釜，分步添加不同的酶实现对香豆酸的间歇化生产。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，该制备方法的具体步骤为：

S1、第一级管式反应酶催化工序：在温度为20-40℃、pH为6-9条件下，添加对羟基苯丙酮酸、葡萄糖，羰基还原酶和葡萄糖脱氢酶进行反应，反应时间为1-3小时；后进入第一级超滤酶回收工序；

S2、第一级超滤酶回收工序：采用有机膜超滤设备对反应体系进行过滤，膜孔径为5-20kD；得到的羰基还原酶和葡萄糖脱氢酶进行回收至S1中循环利用；

S3、第二级管式反应酶催化工序：S2中的渗透液进入通过第二级管式反应器内，在温度为15-35℃、pH为7-10条件下添加脱水酶进行反应，反应时间为1-3小时，后进入第二级超滤工序；

S4、第二级超滤酶回收工序：采用有机膜超滤设备对S3所得反应体系进行过滤，膜孔径为30-50kD；得到的脱水酶回收至S3中循环利用；透过液进入结晶工序，结晶析出对香豆酸，过滤，干燥得产品。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：S1中，羰基还原酶和葡萄糖脱氢酶均以液体酶制剂形式加入；羰基还原酶液态酶制剂的添加量为对羟基苯丙酮酸底物的质量1-5%，葡萄糖脱氢酶的添加量为葡萄糖质量的2-6%。

5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：S1中，反应介质为双水相体系或者有机溶剂单相体系或者水/有机溶剂体系。

6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：S2中羰基还原酶和葡萄糖脱氢酶回收5次以上，回收过程中根据需要补充相应的羰基还原酶和/或葡萄糖脱氢酶液体酶制剂。

7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：S4中脱水酶回收5次以上，回收过程中根据需要补充≤30%的脱水酶液体酶制剂；结晶时温度降低至-5-5℃。