[发明专利]一种八倍体油菜转基因方法以及在基因编辑中的应用

说明书

本发明公开了一种八倍体油菜转基因方法以及在基因编辑中的应用，属于遗传育种技术领域。本发明首次建立八倍体油菜农杆菌介导的转基因方法，将基因编辑载体成功的转化到具有诱导能力的八倍体油菜中，并将具有基因编辑元件活性的花粉直接对母本授粉，进而直接对其进行基因编辑，克服了基因编辑对于遗传转化的依赖性，直接通过授粉的方式对难于进行遗传转化的育种材料进行基因编辑，获得染色体倍性和母本一致双单倍体材料，且获得突变体材料不含有转基因元件，突变效率高达100％。

技术领域

本发明属于遗传育种技术领域，尤其涉及一种八倍体油菜转基因方法及在基因编辑中的应用。

背景技术

油菜，甘蓝等十字花科作物是人们日常生活中最主要的油料和蔬菜作物。多倍体育种技术是一种利用人工杂交，化学诱变等方式获得多倍体新物种的方法。多倍体育种技术对于研究基因组多倍体化后作物器官发育，作物抗逆性和品质改变，以及染色体加倍对异源花粉杂交的影响具有重要的理论研究价值和育种应用前景。

我们前期通过人工杂交结合秋水仙素加倍的方式人工合成了新的油菜异源八倍体材料。田间种植中发现，新合成的油菜八倍体材料形态上和普通四倍体油菜有明显的差异，比如角果更宽，花粉活力强且具有对主要十字花科作物的双单倍体诱导能力。

基因编辑转基因技术是研究基因功能以及作物性状改良的重要工具。但对八倍体油菜转基因的方法还没有建立。到目前为止，只有一篇上世纪80年代发表的关于八倍体油菜组织培养再生的报道，但是否能够达到转基因的条件，还没有有效突破。这严重阻碍了油菜多倍体相关性状的功能研究。

此外，油菜和甘蓝等十字花科作物的基因编辑技术利用农杆菌介导的基因转化方法将基因编辑载体引入到植物细胞中，主要存在以下两个缺点：(1)农杆菌介导的基因转化方式存在基因型的依赖性，不同的转化受体材料转化能力和转化效率存在巨大差异；(2)农杆菌介导的遗传转化方式引入的大的片段插入，后期需要经过大量的筛选鉴定不含转基因元件的突变体材料。利用单倍体诱导系可以快速的创建基因组纯和的单倍体材料，加速育种进程。单倍体诱导系技术已经广泛的应用在玉米的育种项目中。此外，利用单倍体诱导系的花粉对母本授粉，诱导系的基因组会在授粉的过程中发生降解，不污染母本基因组，单倍体诱导系可以用来传递基因编辑元件，直接对母本的基因组进行编辑，然后通过人工加倍的方式获得不含转基因元件的突变体材料。玉米和小麦种的单倍体诱导系是利用MTL基因的突变获得，但存在以下不足：(1)应用范围狭窄，MTL基因只特异的存在于禾本科植物，不能通过基因编辑的方法在双子叶植物中应用；(2)诱导效率低，MTL单倍体诱导系在禾本科作物中的诱导率为1％到2％，后期筛选强度很大；(3)MTL单倍体诱导系产生的后代为单倍体材料，需要后期人工加倍才能获得可用的整倍体材料，耗时耗力；(4)难于进行遗传转化，只能通过杂交和回交的方式将基因编辑元件转移到诱导系中。

我们以基因编辑载体作为遗传转化的测试载体，成功建立了油菜八倍体遗传转化体系。并利用该遗传转化方法筛选到基因编辑元件发挥效应的转基因材料，使用该材料的花粉对十字花科作物授粉后发现，作为母本受体材料的基因组也产生定点的变异。因此，该方法可以有效规避组织培养对基因型的限制，直接通过授粉的方式对育种材料进行基因突变，可以加速基因编辑技术在育种材料应用的进程。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供一种八倍体油菜转基因方法以及在基因编辑中的应用。

为达上述目的，本发明采用如下的技术方案：

一种八倍体油菜转基因方法，该方法包括以下步骤：

(1)基因编辑载体构建；

(2)八倍体油菜种子预处理及灭菌；

(3)转化根癌农杆菌；

(4)遗传转化八倍体油菜。