[发明专利]诱导干细胞分化为视网膜色素上皮细胞的方法

说明书

本申请涉及一种诱导干细胞分化为视网膜色素上皮细胞(RPE)的方法，其包括以下步骤：在多能干细胞经细胞培养出现细胞状态衰退前，将所述多能干细胞置于第一培养基中培养，其中所述第一培养基包含DMEM培养基、血清、β‑巯基乙醇、非必需氨基酸(NEAA)和L‑谷氨酰胺。本申请所述的方法可以显著提高分化为RPE的效率。

技术领域

本申请涉及生物医药领域，具体的涉及一种诱导干细胞分化为视网膜色素上皮细胞的方法。

背景技术

视网膜变性疾病是全球首要的致盲原因。在该疾病中，视网膜色素上皮细胞(retina pigmented epithelium,RPE)的损伤和功能异常导致光感受器细胞(photoreceptor)变性，最终影响病人视力直至失明。由于RPE和光感受器细胞的不可再生，至今在临床上缺乏对这类疾病的有效治疗措施。

由于干细胞具有无限增殖和分化为各种细胞的能力，因此可以从突变患者身上获得体细胞进行重编程为iPS细胞后诱导成RPE细胞，一方面可以作为疾病模型进行药物筛选，另一方面通过基因编辑后的RPE细胞恢复功能后可作为理想的移植细胞的来源。已有报道证实干细胞来源的RPE应用于人类视网膜退行性疾病临床研究的可行性与安全性，尽管病人术后视力与正常生活的要求还有很大差距。

在过去的十几年间，多种方法被报道可以控制干细胞向RPE细胞分化，但是这些方法仍存在若干缺点如耗时长，方法繁琐，批次间差异大和细胞得率低等缺陷。

因此，需要一种高效诱导干细胞向RPE细胞分化的方法。

发明内容

本申请提供了一种诱导干细胞分化为视网膜色素上皮细胞(RPE)的方法。利用本申请所述的方法可以得到成熟的RPE细胞。此外，本申请所述的方法至少具有选自下组的有益效果：分化效率高，分化周期短，可重复性强，无需外源成分，可用于临床。

一方面，本申请提供了一种诱导干细胞分化为视网膜色素上皮细胞(RPE)的方法，其包括以下步骤：在干细胞经细胞培养出现细胞状态衰退前，将所述干细胞置于第一培养基中培养，其中所述第一培养基包含DMEM培养基、血清、β-巯基乙醇、非必需氨基酸(NEAA)和L-谷氨酰胺。

在某些实施方式中，所述第一培养基包含DMEM培养基、血清、β-巯基乙醇、非必需氨基酸(NEAA)和GlutaMAX^TM。

在某些实施方式中，DMEM培养基包含KnockOut^TMDMEM和/或DMEM/F-12。

在某些实施方式中，所述血清包含临床级血清替代物。

在某些实施方式中，所述血清包含KnockOut^TM血清替代物。

在某些实施方式中，所述NEAA包含L-丙氨酸、L-谷氨酸、L-天(门)冬酰胺、L-天(门)冬氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸和/或甘氨酸。

在某些实施方式中，在所述第一培养基中，所述血清的浓度为约10％(v/v)-约30％(v/v)。

在某些实施方式中，在所述第一培养基中，所述β-巯基乙醇的浓度为约0.1％(v/v)-约1％(v/v)。

在某些实施方式中，在所述第一培养基中，所述NEAA的浓度为约0.5％(v/v)-约2％(v/v)。

在某些实施方式中，在所述第一培养基中，所述L-谷氨酰胺的浓度为约0.5％(v/v)-约2％(v/v)。

在某些实施方式中，在所述第一培养基中，所述GlutaMAX^TM的浓度为约0.5％(v/v)-约2％(v/v)。

在某些实施方式中，所述第一培养基还包含激活素A(Activin A)。