[发明专利]用于构建small RNA文库的接头、试剂盒及small RNA文库的构建方法

说明书

本发明公开了一种用于构建small RNA文库的接头、试剂盒及small RNA文库的构建方法。其中，该接头包括3’端接头，3’端接头为SEQ ID NO：1所示的随机末端接头，其中，N表示随机碱基；3’端接头的5’末端连接一个rApp，3’末端连接一个封闭基团，5’末端的第二位碱基修饰有MP。进一步地，接头还包括5’端接头，5’端接头为SEQ ID NO：2所示的末端接头，5’端接头的3’末端具有2’OMe修饰。应用本发明的技术方案，3’端接头的MP修饰和5’端接头的2’OMe修饰，能够有效的防止3’端接头和5’端接头连接，提高接头连接效率，降低建库的起始量。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种用于构建small RNA文库的接头、试剂盒及small RNA文库的构建方法。

背景技术

Small RNA主要指的是20-30nt长的小RNA，包括miRNA、snRNA、snoRNA、piwiRNA等，在基因调控中起到非常重要的作用。近年来，随着高通量测序技术的发展，small RNA的种类、表达水平以及功能特点不断被挖掘出来。目前，标准的small RNA建库可参考NEB建库试剂盒(NEB#E7300S)，以1μg总RNA起始，首先进行3’端接头连接，随后用反转录引物与3’端接头杂交封闭，防止残留的3’端接头在5’端接头连接反应中产生非特异性二聚体；紧接着，进行5’端接头连接，再通过反转录合成cDNA，在PCR扩增后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)，对文库区域进行切胶并回收纯化，得到最终上机文库。

现有技术的缺点是建库起始量高，一般以1μg起始，不适合稀有物种样本建库；反转录引物封闭不理想，导致5’端接头连接反应产生非特异性连接；PCR扩增过程中产生较多非特异性扩增，导致文库产率低；上机前需切胶回收纯化文库，制胶跑胶及切胶回收时间长，导致整体建库时间延长。

发明内容

本发明旨在提供一种用于构建small RNA文库的接头、试剂盒及small RNA文库的构建方法，以解决现有技术中small RNA建库起始量过高的技术问题。

为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种用于构建small RNA文库的接头。该接头包括3’端接头，3’端接头为SEQ ID NO：1所示的随机末端接头，其中，N表示随机碱基；3’端接头的5’末端连接一个rApp，3’末端连接一个封闭基团，5’末端的第二位碱基修饰有MP。

进一步地，接头还包括5’端接头，5’端接头为SEQ ID NO：2所示的末端接头，5’端接头的3’末端具有2’OMe修饰。

根据本发明的另一个方面，提供一种用于构建small RNA文库的试剂盒。该试剂盒包括上述接头。

进一步地，试剂盒还包括3’端接头连接体系试剂和5’端接头连接体系试剂，3’端接头连接体系试剂包括RNAse抑制剂、截短型T4连接酶2、10％～30％PEG8000和10％～30％DMSO。

进一步地，5’端接头连接体系试剂包括1×T4 ligase1 buffer、RNAse抑制剂、T4连接酶1和ATP，其中，1×T4 ligase1 buffer包括50mM Tris-HCl、10mM MgCl₂和1mM DTT，pH 7.5。

进一步地，试剂盒还包括如SEQ ID NO：3所示的反转录引物。

进一步地，试剂盒还包括如SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5所示的PCR扩增引物。

根据本发明的再一个方面，提供一种small RNA文库的构建方法。该构建方法包括：获取small RNA样本，采用上述任一种用于构建small RNA文库的试剂盒进行small RNA文库的构建。