[发明专利]用于构建small RNA文库的接头、试剂盒及small RNA文库的构建方法

权利要求书

1.一种用于构建small RNA文库的接头，其特征在于，所述接头包括3’端接头，所述3’端接头为SEQ ID NO：1所示的随机末端接头，其中，N表示随机碱基；所述3’端接头的5’末端连接一个rApp，3’末端连接一个封闭基团，5’末端的第二位碱基修饰有MP；所述接头还包括5’端接头，所述5’端接头为SEQ ID NO：2所示的末端接头，所述5’端接头的3’末端具有2’OMe修饰。

2.一种用于构建small RNA文库的试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1所述的接头。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括3’端接头连接体系试剂和5’端接头连接体系试剂，所述3’端接头连接体系试剂包括RNAse抑制剂、截短型T4连接酶2、10％～30％PEG8000和10％～30％DMSO。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述5’端接头连接体系试剂包括1×T4ligase1 buffer、RNAse抑制剂、T4连接酶1和ATP，其中，所述1×T4 ligase1 buffer包括50mM Tris-HCl、10mM MgCl₂和1mM DTT，pH 7.5。

5.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括如SEQ ID NO：3所示的反转录引物。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括如SEQ ID NO：4和SEQID NO：5所示的PCR扩增引物。

7.一种small RNA文库的构建方法，其特征在于，包括：获取small RNA样本，采用如权利要求2至6中任一项所述的用于构建small RNA文库的试剂盒进行small RNA文库的构建。

8.根据权利要求7所述的构建方法，其特征在于，采用如权利要求2至6中任一项所述的用于构建small RNA文库的试剂盒进行small RNA文库的构建包括以下步骤：

3’端接头连接：采用3’端接头连接体系试剂配制3’端接头连接混合液进行small RNA和3’端接头连接，得到连接有3’端接头的small RNA，其中，所述3’端接头连接混合液包括10U～40U RNAse抑制剂、100U～300U截短型T4连接酶2或截短型T4连接酶2KQ、10％～30％PEG8000和10％～30％DMSO；

5’端接头连接：采用5’端接头连接体系试剂配制5’端接头连接混合液进行所述连接有3’端接头的small RNA和5’端接头连接，得到连接有3’端接头和5’端接头的small RNA，其中，所述5’端接头连接混合液包括1×T4 ligase1 buffer、10～40U RNAse抑制剂、10U～30U T4连接酶1和1mM～20mM ATP；

反转录反应：采用SEQ ID NO：3所示的反转录引物对所述连接有3’端接头和5’端接头的small RNA进行反转录，得到cDNA；

纯化cDNA产物：使用磁珠进行纯化cDNA，去除二聚体；

PCR扩增并纯化：使用Q5 Mix进行文库扩增，扩增引物如SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5所示的PCR扩增引物；使用磁珠进行纯化。

9.根据权利要求8所述的构建方法，其特征在于，所述3’端接头连接的条件为20-37℃孵育10分钟～2小时，65～85℃酶灭活。

10.根据权利要求8所述的构建方法，其特征在于，所述5’端接头连接的条件为25～28℃孵育10min～2小时，65～85℃酶灭活20min，4℃放置5min。

11.根据权利要求8所述的构建方法，其特征在于，所述PCR扩增的反应条件为：第一阶段：95℃，3min；第二阶段：98℃10s，65℃30s，72℃30s，共15个循环；第三阶段：72℃2min。