[发明专利]一种基于环境DNA的长江江豚检测试剂盒及其应用

说明书

本发明公开了一种淡水珍稀哺乳动物—长江江豚在淡水环境中快速检测方法，属于生物技术领域。本发明首先基于我国长江江豚全线粒体组设计了1对等温扩增引物和探针，该引物具有特异性好、稳定性高的特点，等温PCR扩增中成功率高，可以很好对长江江豚DNA进行PCR扩增，可广泛应用于长江江豚DNA的快速检测以及物种保护等研究中。本发明还配合环境DNA技术以及恒温扩增PCR技术，提供了针对长江江豚基因快速检测的试剂盒，无需经过测序，通过核酸检测试纸条可得知阳性或阴性结果，成本低，操作简便，耗时10‑20分钟，能快速准确的对淡水环境中长江江豚基因进行检测。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种基于环境DNA的长江江豚检测试剂盒及其应用。

背景技术

长江江豚(Neophocaenaphocaenoidesasiaeorientalis)是一种小型齿鲸，被列为国家二级保护动物，主要分布于长江中下游干流、洞庭湖和鄱阳湖及其主要支流，是一个相对独立的淡水亚种。近年来，长江江豚由于航运、过度及非法捕捞，种群数量快速衰退，现已被世界自然保护联盟物种生存委员会(IUCN SSC)列为“极度濒危”(CR)物种，检测和保护长江江豚迫在眉睫。

环境DNA是环境中生物有机体释放在环境中的DNA片段，主要来源于脱落的皮肤细胞、尿液、粪便、体液或其他身体分泌物。环境DNA技术是利用各种分子手段识别环境DNA中所包含的信息，从而确定生物在环境中的分布情况。

公布号为CN108624585A的中国发明专利公开了一种长江江豚环境DNA提取方法及其应用，该发明从长江江豚线粒体D-Loop区域设计1对特异性引物，进行实时荧光定量PCR扩增，并根据溶解曲线的峰值确定鉴定区域是否有长江江豚生存。该方案中荧光定量PCR方法，一方面需要高温、变性和退火等步骤，历时较长；另一方面需要昂贵的仪器设备且需要专业技术人员进行操作，难以满足非实验室等基层现场环境下的检测要求。此外，环境样品中游离长江江豚DNA浓度低，现有细胞色素氧化酶I(COI，cytochromecoxidaseI)基因引物对环境样本中江豚DNA的扩增能力较差。

因此，开发特异性强、稳定性高的引物，能够在基层现场条件下简单、快速、高效的扩增长江江豚环境DNA以检测长江江豚是否存在显得尤为重要。

发明内容

1.要解决的问题

本发明主要针对传统引物对环境样本中江豚DNA的扩增能力差、荧光定量PCR扩增依赖昂贵设备导致无法现场检测长江江豚是否存在等问题，依据长江江豚的DNA设计了1对等温扩增引物和探针，并开发了一种基于环境DNA的长江江豚检测试剂盒，能够在现场富集水中的DNA，在常温下快速、高效扩增长江江豚基因，能够快速检测扩增产物，从而实现对长江江豚是否存在的快速检测。

2.技术方案

为了解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下：

本发明提供了一种用于检测长江江豚DNA的引物组，包括上游引物和下游引物，所述引物组的上游引物序列为：TGTCCACTAGCCCTTCATAACCATTATATCCT(5’-3’)；所述引物组的下游引物序列为：GCTGATTAGTCATTAGTCCATCGAGATGTCTT(5’-3’)。该引物组能够在长江江豚DNA浓度较低情况下实现长江江豚DNA的扩增。

优选地，上述引物组下游引物的5’端标记一个修饰基团，如生物素Biotin或地高辛Digoxin。

本发明还提供了一种与上述引物组配合使用的探针，所述探针的序列为：CTCCATTAGATCACGAGCTTAATCACCATGCCGCGTGAAACCAGCAAC(5’-3’)。

优选地，上述探针的5’端标记一个修饰集团，如FAM或FITC。