[发明专利]一种基于环境DNA的长江江豚检测试剂盒及其应用

权利要求书

1.一种用于检测长江江豚DNA的引物组，其特征在于，所述引物组的上游引物序列为：TGTCCACTAGCCCTTCATAACCATTATATCCT(5’-3’)；所述引物组的下游引物序列为：GCTGATTAGTCATTAGTCCATCGAGATGTCTT(5’-3’)。

2.根据权利要求1所述的一种用于检测长江江豚DNA的引物组，其特征在于，所述引物组下游引物的5’端标记生物素Biotin或地高辛Digoxin。

3.一种与权利要求1或2所述的引物组配合使用的探针，其特征在于，所述探针的序列为：CTCCATTAGATCACGAGCTTAATCACCATGCCGCGTGAAACCAGCAAC(5’-3’)；所述探针的5’端标记FAM或FITC；所述探针距5’端25～35个碱基的位置上标记dSpacer；所述探针3’端标记胺基、磷酸基团或C3-spacer中的一种。

4.一种长江江豚快速检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求2所述引物组和权利要求3所述的探针。

5.根据权利要求4所述的一种长江江豚快速检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒为核酸检测试纸条试剂盒，所述的核酸检测试纸条为通用型核酸检测试纸条；所述核酸检测试纸条上有C线和T线，其中，C线上埋有下游引物5’端修饰基团对应的抗体，T线埋有探针5’端修饰基团对应的抗体。

6.根据权利要求5所述的一种长江江豚快速检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括包括重组酶，聚合酶，ddH₂O及PCR缓冲液。

7.根据权利要求6所述的一种长江江豚快速检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括核酸抽提试剂盒，所述核酸抽提试剂盒包括：无菌注射器，集成0.45微米孔径滤的针筒式过滤器，裂解液，中和管，洗涤管，洗脱管，磁珠及磁棒。

8.权利要求4-7任一所述的一种长江江豚快速检测试剂盒的应用，其特征在于，包括如下步骤：以环境DNA为模板进行等温扩增、试纸条检测等温扩增结果，所述环境DNA是从环境源中抽提的DNA，所述环境源包括水样和/或沉积物。

9.根据权利要求8所述的一种长江江豚快速检测试剂盒的应用，其特征在于，

所述等温扩增包括如下步骤：

(1)向PCR扩增管中依次加入重组酶，聚合酶，上游引物，下游引物，探针，环境DNA，PCR缓冲液和ddH₂O并混合均匀，37-42℃恒温反应10-15min；

(2)反应结束后，用无菌水稀释10-100倍，混合均匀。

所述试纸条检测包括如下步骤：

(1)取上述混合均匀的反应液加入到核酸检测试纸条的加样孔中，1-2min后读取试纸条上的结果；

(2)判断标准：C线和T线均显色：检测阳性；C线显色和T线不显色：检测阴性；C线和T线均不显色：检测无效；C线不显色：检测无效。

10.根据权利要求8或9所述的一种长江江豚快速检测试剂盒的应用，其特征在于，所述环境DNA通过试剂盒中提供的核酸抽提试剂盒进行，包括如下步骤：

(1)用无菌注射器吸取水样，将注射器连接到针筒过滤器上，推注射器让水样全部通过针筒过滤器，重复该操作直到针筒过滤器堵塞为止，取下无菌注射器；

(2)向针筒过滤器中加入裂解液，用手震荡针筒过滤器，将针筒过滤器中的液体吸出，加入装有中和液的离心管中，加入磁珠并上下混匀；

(3)将磁棒插入离心管中静置，待磁珠被全部吸附到磁棒后，将磁棒插入洗涤管中，上下混匀；

(4)将磁棒插入洗脱管中，取下磁棒套，上下混匀后静置，待DNA充分解离后取出磁棒。