[发明专利]一种羰基类代谢物的衍生化方法及非靶向代谢组学高效分析方法

说明书

本发明涉及一种羰基类代谢物的衍生化方法及非靶向代谢组学高效分析方法，其中，羰基类代谢物的衍生化方法包括：步骤1：待检测样品采用第一溶剂进行羰基类代谢物提取，之后进行干燥除掉第一溶剂，得到干燥样本；步骤2：将所述干燥样本溶解，加入pH调节试剂调节pH，之后加入丹磺酰肼，混合均匀后加热进行孵育，之后降温以终止反应，干燥处理得到固体，所述固体复溶，获得衍生化样本。非靶向代谢组学高效分析方法采用上述衍生化方法同步进行¹²C标记+¹³C标记，使得代谢物检测灵敏度升高，可同时检测到更多的代谢物，代谢物覆盖率更高；检测到的代谢物为一个峰对，降低仪器漂移和基质带来的影响，消除噪声干扰，使得定量更精准。

技术领域

本发明涉及代谢组学分析技术，尤其是一种羰基类代谢物的衍生化方法及非靶向代谢组学高效分析方法。

背景技术

代谢组学作为系统生物学的重要组成部分，在临床医学领域具有广泛的应用前景。代谢组学分析技术包括：NMR、GC-MS、CE-MS、LC-MS，这些技术虽然在一定程度上都能检测出代谢物，但是仍然存在诸多困难，如代谢物离子化效率低、质谱信号弱、定量缺少同位素内标、检测到的代谢物数量少、干扰多等问题。

例如，LC-MS采用液相色谱-质谱联用的方法进行分析，比较不同样本中各自的代谢产物以确定其中所有的代谢产物。从本质上来说，代谢指纹分析涉及比较不同个体中代谢产物的质谱峰，最终了解不同化合物的结构，建立一套完备的识别这些不同化合物特征的分析方法。对于代谢产物来说，不仅只有质谱峰这个特征。而且，质谱(MS)并不能检测出所有的代谢产物，并不是因为质谱的灵敏度不够，而是由于质谱只能检测离子化的物质，但有些代谢产物在质谱仪中不能被离子化，因此出现测不准问题。

为了解决上述问题，现有技术中有采用靶向代谢组学技术，对特定目标进行分析。靶向代谢组学是指：针对几种目标化合物或某条通路上涉及的全部或部分代谢物，利用标准品，构建特异性强、灵敏度高、重复性好的检测方法，对目标化合物进行定量与分析。靶向代谢组学只重点研究已知可能具有生物学效应的几种或几类代谢物，因此其数据处理相比于非靶向代谢组学更为简单方便。例如，专利申请CN107085032A公开了一种化学衍生化基质辅助激光解析电离飞行时间质谱技术(MALDI-TOF-MS)的分析方法，包括以下步骤：(1)小分子化合物：以二醛类化合物为连接臂，通过缩合反应修饰至氨基化合物上，使药物代谢产物结构衍生出醛基基团。(2)多肽衍生化小分子化合物：将醛类化合物、多肽以摩尔比50-100:1加入到pH为4-6的磷酸缓冲液中，在5-37℃下发生缩合反应，多肽的氨基酸序列N端半胱氨酸修饰，作为醛类化合物衍生化试剂。(3)MALDI-TOF-MS分析：样品衍生化按照1μL样品混合基质α-氰基-4-羟基肉桂酸CHCA点板，室温风干后进行基质辅助激光解析电离-飞行时间质谱，采用正离子反射模式。该方法使用二醛类化合物对含有氨基结构药物代谢物进行修饰，仅限于药物中的氨基代谢物的情况，虽然有同位素内标，但是不是为所有检测到的代谢物提供相应的同位素内标，因此仍然存在不准确问题。

相对的，非靶向代谢组学是指采用LC-MS、GC-MS、NMR等技术，无偏向性的检测细胞、组织、器官或者生物体内受到刺激或扰动前后所有小分子代谢物(主要是相对分子量1000Da以内的内源性小分子化合物)的动态变化，并通过生信分析筛选差异代谢物，对差异代谢物进行通路分析，揭示其变化的生理机制。由于非靶向代谢组学没有确定的靶向，因此，原始数据的差异性大，且数据量大，如何从其中获得理想的分析结果，是非靶向代谢组学所要解决的问题之一。