[发明专利]靶向敲除ATG5基因的gRNA引物、表达系统、细胞株、构建方法

说明书

本发明涉及生物技术领域，具体涉及靶向敲除ATG5基因的gRNA引物、表达系统、细胞株。本发明确定靶向ATG5基因的gRNA引物，第一靶点序列T1序列为AGTGGATAATCTTTATGGCATGG；第二靶点序列T2序列为TCATGACAACATGCTGACAGTGG。本发明构建的ATG5基因敲除的人血管内皮细胞株的总蛋白，检测自噬效应蛋白LC3‑Ⅰ/LC3‑Ⅱ、p62和Beclin‑1，结果显示自噬效应蛋白的表达增强，表明本发明构建的细胞株成功敲除ATG5基因，沉默ATG5基因的表达，能够应用于ATG5基因在引起内皮细胞向间充质的转化和凋亡的作用机制。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及靶向敲除ATG5基因的gRNA引物、表达系统、细胞株。

背景技术

自噬作为一种进化上保守的过程，通过降解溶酶体中功能冗余或受损的胞内细胞器来维持细胞内的动态平衡。众多研究表明，自噬在多种生理和病理过程中发挥重要作用，包括细胞生长、细胞分化和增殖、免疫反应、癌症、神经变性和衰老等，自噬通路也就成为是很多疾病潜在的靶向治疗通路。

自噬相关基因ATG5是自噬小体的重要组成部分，ATG5通过与ATG12复合体的形成，自噬小体能够得以延伸。自噬相关基因ATG5对于细胞发育、细胞分化以及维持细胞内稳态平衡发挥重要作用。ATG5依赖的自噬的缺乏会诱导内皮炎症，从而导致肝内皮细胞自噬涉及内皮细胞向间充质的转化和凋亡。

内皮细胞损伤是血管疾病的一个关键危险因素，并且内皮细胞的自噬对于内皮细胞的完整性是必不可少的，内皮自噬紊乱可能会诱发组织器官纤维化，而目前还没有研究报道血管内皮细胞中敲除ATG5基因是否在自噬起着重要作用从而影响内皮细胞向间充质的转化和凋亡。构建ATG5基因敲除或沉默表达的细胞模型，对研究ATG5基因与内皮细胞损伤引起的血管疾病的发展机制、靶向用药治疗机制等具有重要的应用价值。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种靶向敲除ATG5基因的gRNA引物，靶向ATG5序列成功敲除ATG5基因，沉默ATG5基因的表达。

本发明的目的之二于提供一种ATG5基因敲除用表达系统。

本发明的目的之三在于提供一种ATG5基因敲除的人血管内皮细胞株。

本发明的目的之四在于提供一种ATG5基因敲除的人血管内皮细胞株的构建方法。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

一种靶向敲除ATG5基因的gRNA引物，由靶向第一靶点T1的第一gRNA引物和靶向第二靶点T2的第二gRNA引物组成；其中第一靶点T1序列为AGTGGATAATCTTTATGGCATGG，如SEQID NO：1所示；第二靶点T2序列为TCATGACAACATGCTGACAGTGG，如SEQ ID NO：2所示。

可选的，所述第一gRNA引物的序列为：ATG5-gF1：CACCG

AGTGGATAATCTTTATGGCA，如SEQ ID NO：3所示；ATG5-gR1：

AAACTGCCATAAAGATTATCCACTC，如SEQ ID NO：4所示；

第二gRNA引物的序列为ATG5-gF2：CACCGTCATGACAACATGCTGACAG，如SEQ ID NO：5所示；ATG5-gR2：AAACCTGTCAGCATGTTGTCATGAC，如SEQ ID NO：6所示。

一种ATG5基因敲除用表达系统，由表达载体和报告载体组成；其中表达载体由以靶向第一靶点T1的第一gRNA引物为拟合引物构建的的第一载体和以靶向第二靶点T2的第二gRNA引物为拟合引物构建的的第二载体组成；第一载体和第二载体均为CRISPR/Cas9；报告载体为以含有第二靶点T2的Tar引物为拟合引物构建的SSA-RPG。