[发明专利]靶向敲除ATG5基因的gRNA引物、表达系统、细胞株、构建方法

权利要求书

1.一种ATG5基因敲除用表达系统，其特征在于，由表达载体和报告载体组成；其中表达载体由以第一gRNA引物为拟合引物构建的的第一载体和以第二gRNA引物为拟合引物构建的的第二载体组成；第一载体和第二载体均为CRISPR/Cas9；报告载体为以含有第二靶点的Tar引物为拟合引物构建的SSA-RPG；其中第一gRNA引物靶向第一靶点T1，第一靶点T1序列为AGTGGATAATCTTTATGGCATGG，如SEQ ID NO：1所示；第二gRNA引物靶向第二靶点T2，第二靶点T2序列为TCATGACAACATGCTGACAGTGG，如SEQ ID NO：2所示；

第一gRNA引物的序列为：ATG5-gF1：CACCG AGTGGATAATCTTTATGGCA，如SEQ ID NO：3所示；ATG5-gR1：AAACTGCCATAAAGATTATCCACTC，如SEQ ID NO：4所示；

第二gRNA引物的序列为ATG5-gF2：CACCGTCATGACAACATGCTGACAG，如SEQ ID NO：5所示；ATG5-gR2：AAACCTGTCAGCATGTTGTCATGAC，如SEQ ID NO：6所示；

Tar引物的序列为：ATG5-TF：

GGCCGCCTCGAGCCTCTAATGCTACCACTCAGAGGTCATGACAACATGCTGACAG TGGTGATGAG，如SEQID NO：7所示；

ATG5-TR：

GATCCTCATCACCACTGTCAGCATGTTGTCATGACCTCTGAGTGGTAGCATTAGAG GCTCGAGGC，如SEQID NO：8。

2.一种ATG5基因敲除的人血管内皮细胞株，其特征在于，由如权利要求1所述的表达系统中的第一载体、第二载体和报告载体同时转染HUVEC构建而成。

3.一种如权利要求2所述的ATG5基因敲除的人血管内皮细胞株的构建方法，其特征在于，包括以下操作步骤：

1)构建表达载体和报告载体：

A：构建第一表达载体：

a:合成靶向ATG5的第一靶点T1的第一gRNA引物；

b：将第一gRNA引物拟合，得拟合产物；

c：用BsaⅠ酶切质粒pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9即CRISPR/Cas9表达载体，将酶切回收的骨架和拟合产物连接，然后将连接产物转化感受态细菌DH5α，涂含氨苄青霉素的LB固体培养基的平板上，培养后挑取单克隆，接种在含氨苄青霉素LB液体培养基中，培养后离心收集菌体，提取质粒，获得靶向ATG5基因的第一载体，记为ATG5-1.CRISPR/Cas9；

B：合成靶向ATG5的第二靶点T2的第二gRNA引物，按照构建第一表达载体同样的构建方法构建第二表达载体，记为ATG5-2.CRISPR/Cas9；

C：合成含有第二靶点T2的Tar引物，以SSA-RPG为骨架，按照构建第二表达载体同样的构建方法构建报告载体，记为ATG5.SSA-RPG；

2)转染与筛选：

将步骤1)构建的ATG5-1.CRISPR/Cas9、ATG5-2.CRISPR/Cas9和ATG5.SSA-RPG同时转染到HUVEC细胞中，嘌呤霉素筛选后，挑取单克隆，即构建获得ATG5基因敲除的人血管内皮细胞株。

4.如权利要求3所述的ATG5基因敲除的人血管内皮细胞株的构建方法，其特征在于，步骤b中拟合体系是上下游引物各5ul，拟合程序是100℃10分钟，然后放置常温后再放至4℃。

5.如权利要求4所述的ATG5基因敲除的人血管内皮细胞株的构建方法，其特征在于，步骤c中酶切反应体系为：pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9 4μL，BsaⅠ0.8μL，CutSmart 4μL，H₂O 31.2μL，37℃酶切4小时。