[发明专利]一种无肌间刺鲫品系培育方法

权利要求书

1.一种无肌间刺鲫品系培育方法，其特征在于按以下步骤进行无肌间刺鲫品系培育：

针对bmp6基因在鲫基因组中的2个拷贝bmp6a和bmp6b分别设计敲除靶位点，然后通过2轮基因敲除和筛选，获得F2代bmp6a和bmp6b双基因突变纯合系，然后利用F2代bmp6a和bmp6b双基因突变纯合系进行扩繁形成无肌间刺鲫新品系；

其中，用bmp6a或bmp6b或bmp6a和bmp6b上对应的sgRNA与Cas9蛋白混合后显微注射鲫单细胞期胚胎，进行第一轮基因敲除，构建F0代群体，然后F0代群体养殖3～5个月进行PIT标记和DNA提取，再进行测序确定鲫个体体细胞突变的等位基因及突变率，选取体细胞突变系且体细胞突变率为95％以上的F0代个体作为亲本制备0代受精卵；

用bmp6a或bmp6b或bmp6a和bmp6b上对应的sgRNA与Cas9蛋白混合后显微注射0代受精卵，进行第二轮基因敲除，构建F1代群体，然后F1代群体养殖3～5个月进行PIT标记和DNA提取，再进行测序确定鲫个体体细胞突变的等位基因及突变率，选取体细胞bmp6a和bmp6b双基因突变系且体细胞突变率为95％以上的F1代作为亲本进行繁殖，构建F2代，再从F2代中选取bmp6a和bmp6b双基因突变纯合系。

2.根据权利要求1所述的无肌间刺鲫品系培育方法，其特征在于bmp6基因的敲除靶位点如表1所示，

表1

3.根据权利要求2所述的无肌间刺鲫品系培育方法，其特征在于采用如表1所示的sgRNA上游引物和序列为5’-GATCCGCACCGACTCGGTGCCACTTTTTCAAGTTGATAACGGACTAGCCTTATTTTAACTTGCTATTTCTAGCTCTAAAAC-3’的sgRNA下游引物，进行sgRNA体外合成；sgRNA体外扩增体系为：10μM sgRNA上游和下游引物各2.5μL、2×Dream Taq Master mix 25μL、无酶水补充至50μL；sgRNA体外扩增程序为95℃变性3min，之后30个循环设置为95℃30s、58℃30s、72℃30s，72℃延伸5min；扩增后，将PCR产物纯化回收，然后利用RNA体外转录试剂盒进行sgRNA体外转录，每个靶位点建立30μl反应体系：sgRNA PCR回收产物1μg、NTP Buffer Mix10μL、T7 RNA Polymerase Mix 2μL，用无酶水补足30μL；37℃转录4h，反应结束加入20μl无酶的水，混匀后加入2μl DNase I，在37℃消化15min，去除未反应的DNA。

4.根据权利要求3所述的无肌间刺鲫品系培育方法，其特征在于显微注射的方法是：体外合成的sgRNA和Cas9蛋白按3:1的摩尔浓度比混合后室温孵育10min，再加入25％的酚红，注射到鲫单细胞期的胚胎中；其中，每个外显子上的靶位点sgRNA等量混合后进行注射，每个sgRNA终浓度均不低于50ng/μL，每粒受精卵注射量1nL±0.02nL。