[发明专利]靶向骨肉瘤细胞的外泌体药物递送系统的制备方法及其应用

说明书

本发明涉及靶向给药技术领域，具体为一种靶向骨肉瘤细胞的外泌体药物递送系统的制备方法，包括构建pCMV‑lamp2b质粒；将人体骨肉瘤细胞特异性多肽OSP‑1插入到pCMV‑1amp2b质粒上；制备含外泌体的上清液和超速离心法制备外泌体。本发明公开一种靶向骨肉瘤细胞的外泌体药物递送系统的应用，在于外泌体特异性靶向骨肉瘤细胞，使其内部装载药物靶向释放，特异性杀灭癌细胞。有益效果为：本发明采用人体骨肉瘤细胞特异性多肽OSP‑1作为外泌体的靶向多肽，分子质量小，能够增加携带基因的容量，并且人体骨肉瘤细胞特异性多肽OSP‑1的潜在靶点为硫酸乙酰肝素糖蛋白，其可以与骨肉瘤细胞有效且特异性结合，靶向性好，转染骨肉瘤细胞的效率高，具有广阔的应用前景。

技术领域

本发明涉及靶向给药技术领域，具体为一种靶向骨肉瘤细胞的外泌体药物递送系统的制备方法及其应用。

背景技术

药物递送系统(Drug Delivery System，DDS，药物传递系统)是指在空间、时间及剂量上全面调控药物在生物体内分布的技术体系。其目标是在恰当的时机将适量的药物递送到正确的位置，从而增加药物的利用效率，提高疗效，降低成本，减少毒副作用。药物递送系统研究对象既包括药物本身，也搭载药物的载体材料、装置，还包括对药物或载体等进行物理化学改性、修饰的相关技术。

外泌体是直径为30-100nm的内吞衍生囊泡，由于外泌体包含的各种物质均来源于其细胞，如蛋白质，RNA，双链DNA，代谢分子。并且外泌体的体积非常小，这点优势使得他们可以逃避机体内的单核吞噬细胞系统的吞噬作用，并且可以穿过血管内皮细胞，到达下游的目的细胞。另外，外泌体具有生物来源的特点，使得其免疫原性比较低，外泌体可以通过和其他细胞的细胞膜进行融合，发生内吞，从而将外泌体的内容物释放到下游细胞中来发挥作用，也可以通过细胞膜表面受体相互作用与靶细胞进行交流，将内含物释放至靶细胞中，运用此类方法，可以减少基因药物的降解，逃避溶酶体途径。

目前，选用最多的是将外泌体的标志物即四跨膜蛋白CD63，CD81，CD9作为引导，将其他目的基因或者荧光蛋白，与标志物蛋白进行融合表达，从而将表达的外源基因引导带至外泌体中。然而，运用类似此类标志物有以下几个弊端：第一就是自身基因较大，受载体限制，使得外源基因的选择余地比较小；其次，此类标志物蛋白靶向性比较差，在细胞器膜上，同样也富含此类蛋白，所以导致转化率比较小，效率较低。另外，CD63，CD9，CD81被视为细胞功能的重要蛋白，利用此类蛋白做引导，势必会影响细胞或者是外泌体的功能。

因此，研发一种有效且有特异性，且不影响细胞、外泌体功能的具有靶向外泌体的载体就成为需要迫切解决的一个技术问题。

发明内容

本发明的目的在于提供靶向骨肉瘤细胞的外泌体药物递送系统的制备方法及其应用，以解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种靶向骨肉瘤细胞的外泌体药物递送系统的制备方法，包括以下制备步骤：

步骤一：以小鼠cDNA为模板，用PCR扩增获得外泌体膜蛋白(lamp2b)片段，PCR纯化，得到lamp2b基因；

步骤二：将lamp2b基因克隆到哺乳动物表达载体pCMV-Tag上，构建pCMV-lamp2b质粒；

步骤三：将人体骨肉瘤细胞特异性多肽OSP-1插入到pCMV-lamp2b质粒上，得到OSP-lamp2b重组质粒；

步骤四：将OSP-lamp2b重组质粒转染小鼠的未成熟树枝状细胞，转染48h后，加入G418抗生素，筛选，得到OSP-lamp2b细胞系。

步骤五：将细胞培养用的血清通过离心机进行离心8-10h后，收取上清液，得到无外泌体血清培养液；