[发明专利]靶向骨肉瘤细胞的外泌体药物递送系统的制备方法及其应用在审
| 申请号： | 202110477920.2 | 申请日： | 2021-04-29 |
| 公开（公告）号： | CN113198020A | 公开（公告）日： | 2021-08-03 |
| 发明（设计）人： | 段莉;徐丽梅;梁宇杰;徐晓 | 申请（专利权）人： | 深圳市第二人民医院(深圳市转化医学研究院) |
| 主分类号： | A61K47/46 | 分类号： | A61K47/46;A61K47/42;A61K38/17;A61P35/00;C12N15/85;C12N15/62;C12N5/10;A61K31/704 |
| 代理公司： | 北京挺立专利事务所(普通合伙) 11265 | 代理人： | 吴彩凤 |
| 地址： | 518000 广东省深*** | 国省代码： | 广东;44 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 靶向 骨肉 细胞 外泌体 药物 递送 系统 制备 方法 及其 应用 | ||
1.一种靶向骨肉瘤细胞的外泌体药物递送系统的制备方法，其特征在于：包括以下制备步骤：
步骤一：以小鼠cDNA为模板，用PCR扩增获得外泌体膜蛋白(lamp2b)片段，PCR纯化，得到lamp2b基因；
步骤二：将lamp2b基因克隆到哺乳动物表达载体pCMV-Tag上，构建pCMV-lamp2b质粒；
步骤三：将人体骨肉瘤细胞特异性多肽OSP-1插入到pCMV-lamp2b质粒上，得到OSP-lamp2b重组质粒；
步骤四：将OSP-lamp2b重组质粒转染小鼠的未成熟树枝状细胞，转染48h后，加入G418抗生素，筛选，得到0SP-lamp2b细胞系。
步骤五：将细胞培养用的血清通过离心机进行离心8-10h后，收取上清液，得到无外泌体血清培养液；
步骤六：将OSP-lamp2b细胞系在正常含血清的培养基中培养12-36h后，等待细胞融合度达到60％-70％时，移去原有含血清的培养基，换成含无外泌体血清培养液的培养基，继续培养24-48h，细胞融合度达到80％-95％时，用0.2μm滤器过滤，得到含外泌体的上清液；
步骤七：将含外泌体的上清液放入高速离心机中，设置相对离心力为104g，4度高速离心20-50min后，经0.22μm膜过滤后，设置相对离心力为105g，4度高速离心60-90min后，弃去上清液，加入30-50ml PBS缓冲液，混匀，设置相对离心力为105g，4度高速离心60-90min后，弃去上清液，用30-50ml PBS缓冲液重悬获得外泌体；
步骤八：用电穿孔仪把药物电转到外泌体中，使外泌体包裹药物，实施药物递送。
2.根据权利要求1所述的一种靶向骨肉瘤细胞的外泌体药物递送系统的制备方法，其特征在于：步骤三中，所述人体骨肉瘤细胞特异性多肽OSP-1的核酸序列为：
GCCAGCGGCGCCCTGAGCCCCAGCCGCCTGGACACC。
3.根据权利要求1所述的一种靶向骨肉瘤细胞的外泌体药物递送系统的制备方法，其特征在于：步骤五中，所述离心机采用超速离心机，其相对离心力设置为105g，离心时所用的离心管材料为透明聚丙烯，无外泌体血清培养液放置于4℃冰箱保存。
4.根据权利要求1所述的一种靶向骨肉瘤细胞的外泌体药物递送系统的制备方法，其特征在于：步骤七中，所述PBS缓冲液由80mmol/L的Na2HPO4、1.36mol/L的NaCl、20mmol/L的KH2PO4和26mmol/L的KCl组成，使用前，将PBS缓冲液在37℃水浴至完全溶解后，稀释10倍使用。
5.根据权利要求1所述的一种靶向骨肉瘤细胞的外泌体药物递送系统的制备方法，其特征在于：步骤八中，所述药物为阿霉素、顺铂、甲氨蝶呤、异环磷酰胺中任意一种。
6.一种如权利要求1-5所述的靶向骨肉瘤细胞的外泌体药物递送系统的应用，其特征在于：所述外泌体特异性靶向骨肉瘤细胞，通过释放内部装载药物，特异性杀灭癌细胞。
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