[发明专利]用于检测乙肝病毒的比色传感器及其制备与应用

说明书

本发明公开了一种用于检测乙肝病毒的比色传感器及其制备与应用。所述传感器包括靶标识别部分和信号输出部分，靶标识别部分由乙肝表面抗体(Ab)与修饰有生物素的乙肝表面抗原适体DNA(biotin‑aptamer)组成，当靶物质乙肝表面抗原加入时，其被Ab捕获，而biotin‑aptamer又与抗原结合形成三明治复合物，biotin能与后续加入的链霉亲和素结合；信号输出部分包括由S1、S2、S3、S4四条修饰DNA链形成的DM‑Hemin/G4复合物，能催化TMB显色，发出肉眼可见的蓝光，S4上修饰有生物素，S4上修饰的生物素能与链霉亲和素结合，从而实现对乙肝表面抗原的检测。本发明的方案具有快速简单、灵敏度高、普适性等优点。

技术领域

本发明涉及乙肝病毒检测技术领域，特别是涉及一种用于检测乙肝病毒的比色传感器及其制备与应用。

背景技术

乙型肝炎病毒(HBV)感染是世界范围内的主要健康问题之一，可能导致慢性肝炎、肝硬化和原发性肝癌，特别是如果患者的饮食和健康状况得不到很好的控制。据估计，有20亿人的血清学特征为过去或现在的HBV感染，有3.6亿慢性HBV相关性肝病患者。根据REVEALHBV(病毒载量升高和相关肝病/癌症-乙型肝炎病毒的风险评估)小组的报告，当患者的血清病毒载量＞105拷贝/毫升时，患者的风险尤其高。因此，在HBV感染的早期进行检测和监测是非常重要的。乙型肝炎是中国常见的疾病，病毒浓度的测定可为诊断和治疗提供重要依据。

目前临床上最常用的HBV检测方法是免疫分析和聚合酶链反应(PCR)。免疫分析是以病毒抗原或抗体为靶点的血清学方法，具有良好的选择性和100％的准确度。然而，免疫分析方法受到血清学反应的限制而不能提供定量检测结果。乙型肝炎表面(HBs)抗体是最常用的免疫分析靶点，甚至在HBV感染急性期后几个月出现。在临床应用中，PCR是HBV感染的常规检测方法。定量PCR已被用于通过测量扩增产物的数量来估计病毒DNA的初始数量。实时PCR基于首次检测到PCR产物扩增时阈值周期(CT)的评估。PCR由20-40个重复周期组成，以达到可检测的DNA浓度，因此需要有效控制热循环，因此仪器成本较高。PCR也因其杂交机制而产生错误。因此，鉴于上述传统临床诊断方法存在的缺陷，有必要开发一种具有成本效益高、响应速度快、携带方便、灵敏度高等特点的HBV检测技术。

ssDNA除了作为核酸发挥生物功能以外，其在某些条件下同样具有类似于蛋白酶的酶催化活性。其中一种DNA酶称为G-四链体DNA酶。在这种DNA酶中，富含鸟嘌呤(G)的核酸序列特别容易形成高阶结构，并在K+、Pb²⁺或NH⁴⁺存在下折叠成平行或反平行的G-四链体。最近的研究表明，富G序列可以与Hemin结合形成Hemin/G-四链体复合物而具有类似辣根过氧化物酶(HRP)活性，催化H₂O₂的还原。因此，Hemin/G4DNA酶已被广泛用作取代HRP的催化标记物，为DNA酶与纳米材料的放大检测和偶联为生物传感器或纳米器件的设计提供了新的途径。

基于Hemin/G-四链体辣根过氧化物酶(Hemin/G4-HRP酶)开发的传感技术相比传统检测技术有以下几方面的优点：(1)对反应温度具有广泛的适应性，在高温条件下同样具有催化活性；(2)合成简单快速，而无需传统蛋白酶的繁琐纯化步骤；(3)其对核酸序列具有高度的特异性，单个碱基差异即可产生显著的酶活性改变。但是，Hemin/G4-HRP酶也有一些限制。首先，目前的研究中Hemir/G4酶的催化效率一般达不到蛋白酶的效率；同时，大部分DNA酶检测方法都只能在实验室条件下单纯缓冲液体系中得到验证，复杂生物样本中的检测尚待开发；而且，DNA酶也在仅有的几种反应底物存在时才能发挥作用。

发明内容

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种用于检测乙肝病毒的比色传感器及其制备与应用，本发明的比色传感器将Hemin/G4有目的的编辑聚合至DNA胶束中，形成催化单元，实现对乙肝抗原的高灵敏检测。