[发明专利]一种高产庆大霉素C组分的工程菌及其构建

说明书

本发明提供了一种高产庆大霉素C组分的工程菌及其构建，通过GenP过表达以提升庆大霉素C组分产量的策略及所得高产工程菌，GenP过表达策略可通过位点整合和同源重组两种构建方式获得，使庆大霉素C组分(C1、C1a、C2、C2a)产量提高了34.5％，有望有效降低硫酸庆大霉素产品的生产成本。

技术领域

本发明属于微生物技术领域，尤其是涉及一种高产庆大霉素C组分的工程菌及其构建。

背景技术

庆大霉素是由刺孢小单孢菌(Micromonosporaechinospora)产生的氨基糖苷类抗生素。它由2-脱氧链霉胺和两个糖基(加拉糖胺和绛红糖胺)组成，因C6’位甲基化程度不同而分为C1、C1a、C2、C2a及C2b五种组分。庆大霉素通过与靶细胞内核糖体30S亚基16S rRNA上的氨酰基位点结合，引起mRNA错译，从而干扰蛋白质的合成杀死病原菌。由于其具有广谱的抗菌活性和速效杀菌性，且价格低廉，被广泛应用于临床治疗革兰氏阴性菌感染，特别是对于具有多重耐药性的病原体感染，其具有良好的治疗效果。

在企业实际生产中，随着庆大霉素工业菌株的多次传代，菌株容易出现退化，庆大霉素产量有所下降，制约了庆大霉素的生产，因此寻求合适的策略以提升工业菌株庆大霉素C产量成为亟待解决的问题。传统的自然选育或人工诱变的方式，具有很大的随机性，缺少快速的筛选方法，使得定向获得庆大霉素C高产菌株极其困难，而依托理性的代谢工程改造以提高合成途径中中间体的转化效率，有望快速实现庆大霉素C的高产。

发明内容

有鉴于此，本发明旨在提出一种高产庆大霉素C组分的工程菌及其构建，以解决传统的自然选育或人工诱变的方式，具有很大的随机性，缺少快速的筛选方法，使得定向获得庆大霉素C高产菌株极其困难的问题，快速实现庆大霉素C的高产。

为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：

一种高产庆大霉素C组分的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明的第二目的在于提供上述基因在构建高产庆大霉素C组分工程菌中的应用。

本发明的第三目的在于提供一种高产庆大霉素C组分工程菌YC001、 YC003和YC004，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号分别为 CCTCC No.M2021345，No.M2021346，No.M2021347。

本发明的第四目的在于上述高产庆大霉素C组分工程菌的构建方法，其特征在于：采用位点整合或同源重组进行构建。

位点整合型构建是通过attP整合位点将带有目的基因的质粒整个整合到基因组attB位点处，这样构建的菌株需要抗生素来维持其稳定性，否则会出现质粒的丢失，同时，质粒的存在可能会一定程度降低目标产物的产量，但是此构建周期较同源重组短，而同源重组构建是利用同源臂的重组仅将目的基因整合到染色体的固定位置，为稳定菌株，无需添加抗生素，对于工业生产来说，倾向于使用同源重组方式得到的稳定菌株。

优选地，位点整合包括以下步骤：

(1)以位点整合型质粒为载体，构建不同启动子控制GenP表达的质粒，所述质粒包括启动子、genP基因，启动子控制genP的表达；

(2)通过大肠杆菌介导的三亲本接合转移方法将所述质粒导入刺孢小单孢菌原始菌株；

(3)位点整合方式的GenP过表达菌株的筛选，首先筛选硫链丝菌素抗性菌株，后提取基因组进行PCR验证，筛选成功导入启动子-genP片段的菌株。

优选地，同源重组包括以下步骤：

(1)以复制型质粒为载体，构建GenP表达的同源重组质粒，所述质粒包括rpsLp-cf启动子、genP基因、上下同源臂，rpsLp-cf启动子控制genP 的表达；