[发明专利]基于斑点杂交和染色质免疫共沉淀测序联合检测全基因组DNA加合物的方法

说明书

本发明公开了一种基于斑点杂交和染色质免疫共沉淀测序联合检测全基因组DNA加合物的方法，采用斑点杂交技术检测DNA加合物总量，优化各试验条件，以获得全基因组最大范围的DNA加合状态，再引入染色质免疫共沉淀测序技术原理，利用抗原抗体的特异识别反应，在建立的染毒细胞中，产生了BPDE‑DNA加合物的DNA片段文库，通过测序技术得到伤害图谱，明确全基因组中DNA加合物所在位点，以筛选与BPDE引发肺癌相关的基因，通过BPDE‑DNA加合物抗体结合，特异性地富集BPDE作用的DNA片段进行测序，从而为进一步筛选B[a]P致癌的关键通路和靶点提供了更全面确切的信息。

技术领域

本发明涉及BPDE加合基因的检测、鉴定技术领域，更具体地，涉及一种基于斑点杂交和染色质免疫共沉淀测序联合检测全基因组DNA加合物的方法。

背景技术

苯并[a]芘(B[a]P)，作为烟草、烟雾和环境中常见的多环芳烃之一，是一种典型的DNA损伤致癌物，由于其极强的致突变、致癌作用，国内外均将其列为环境污染的监测项目之一。苯并[a]芘7,8-二醇9,10-环氧苯并[a]芘(benzo(a)pyrene-7,8-dihydrodiol-9,10-epoxide，BPDE)是B[a]P的最终代谢产物，可以与DNA共价结合，与鸟嘌呤形成脱嘌呤加合物，以及与DNA磷酸主链形成磷酸三脂加合物，从而破坏生物大分子如DNA和蛋白质的结构和功能。该活性代谢物与DNA共价结合，在细胞内形成共价BPDE-DNA加合物，最终导致DNA链的断裂，还可以进一步发生突变，例如碱基置换、碱基缺失等等，这一系列反应被认为与肿瘤的发生有关。流行病学研究表明非小细胞肺癌、鼻咽癌与BPDE-DNA加合物水平升高显著相关。

检测致癌物的DNA加合物能在人接触有关致癌物后，提供体内环境相互作用及生物有效作用剂量的信息，目前DNA加合物的监测已被广泛应用于人群调查，可以在一个接触环境中，作为致癌物DNA损伤的生物标志物。但在大量未修饰核苷的情况下，很难特异性地检测出微量DNA损伤。常用的DNA加合物检测方法包括32P-后标记法、色谱-质谱联用法、毛细管电泳法、免疫学法等。早期的研究利用放射性标记的致癌物，通过分离DNA和定量放射性来测定DNA损伤水平。BPDE致突变、致癌是一个具有复杂连锁反应的过程，目前已研究的结论建立在仅对很少一部分基因进行分析的基础上，信息非常有限。而那些在肿瘤发生、发展过程中起关键作用的基因变化还不明确。因此，要阐明BPDE的致突变、致癌机制，首先需要揭示全部基因变异的规律，全面了解细胞对BPDE的应答反应，即明确全基因组与BPDE的相互作用。

染色质免疫共沉淀测序(Chromatin Immunoprecipitation Sequencing,CHIP-Seq)是一种研究体内DNA与蛋白质相互作用的方法，是将ChIP与测序技术相结合，在全基因组范围内分析DNA结合蛋白、组蛋白修饰或核小体的高通量技术，可以应用到任何物种的基因组序列，并能确切得到每一个片段的序列信息，比起基于阵列的前代芯片具有更高的分辨率、更少的噪声和更大的覆盖范围。随着技术不断完善普及，测序成本持续降低，该技术已经在科学研究及临床诊断等各个方面得到广泛应用，成为研究基因调控和表观遗传机制不可或缺的工具。目前该项技术，主要运用于研究活体细胞中蛋白质和DNA相互作用谱，基本原理是在活细胞状态下将蛋白质-DNA复合体交联固定，然后随机切断为一定长度的染色质小片段，接着通过免疫学方法沉淀此复合体，最后特异性地富集目的蛋白所结合的DNA片段，通过对富集到的片断进行纯化、扩增与检测，从而获得与蛋白质相互作用的DNA具体片段信息。