[发明专利]基于体外转录和G4-ThT的荧光传感器及其制备与在HBV DNA检测上的应用

说明书

本发明公开了一种基于体外转录和G4‑ThT的荧光传感器及其制备与在HBV DNA检测上的应用，包括引物1、引物2、两种酶和硫黄素ThT；在逆转录酶作用下靶链与引物1杂交生成第一种DNA双链中间体，该中间体在T7 RNA聚合酶催化作用下体外转录扩增产生短单链RNA；引物2与RNA单链杂交形成RNA‑cDNA，然后在AMV反转录酶的作用下逆转录形成cDNA，得带有富C链的DNA；之后引物1又与带有富C链的DNA杂交生成第二种DNA双链中间体，然后在T7 RNA聚合酶作用下转录出带有RNAG4链的RNA，以此循环反应；RNAG4与硫黄素结合，增强荧光信号，收集荧光信号实现对HBV DNA的检测。本传感器灵敏度高、稳定性强、重现性好。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种基于体外转录和G4-ThT的荧光传感器及其制备与在HBV DNA检测上的应用。

背景技术

乙型肝炎是肝脏的一种病毒性感染，是一个世界性的公共卫生问题，具有急性和慢性的临床后果。感染乙肝病毒(HBV)的人患肝癌和肝衰竭的风险很高。这种疾病通过血液和体液传播。为了筛选这种病毒，主要使用乙型肝炎表面抗原(HBsAg)和可溶性抗原乙型肝炎e抗原(HBeAg。有时在感染的第一阶段，HBsAg不存在或检测不到。因此，发展超灵敏的方法对早期检测病毒是必要的。对于这种病毒的检测，HBV基因组DNA的检测比HBsAg更可靠。目前，临床上基于这种病毒的DNA分析主要使用荧光定量聚合酶链反应(qPCR)。然而，这种方法费时费力，因此促使研究人员开发快速和高灵敏度的新方法来准确检测HBV DNA。

发明内容

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种基于体外转录和G4-ThT的荧光传感器及其制备与在HBV DNA检测上的应用，用于解决现有技术中HBV DNA检测方法qPCR法费时费力、成本高等问题。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明第一方面提供一种基于体外转录和G4-ThT的荧光传感器，包括一对引物链、T7 RNA聚合酶、AMV反转录酶和硫黄素ThT，所述引物链包括DNA单链引物1和引物2，所述引物1包括T7序列部分和与靶链互补序列部分，所述引物2包括富C序列部分和与靶链相同序列部分；

所述靶链可与引物1的互补序列部分杂交，在逆转录酶作用下在引物1和靶链的两端延伸出第一种DNA双链中间体，所述第一种DNA双链中间体包含T7 RNA聚合酶识别位点，可在T7 RNA聚合酶催化作用下体外转录扩增产生大量短单链RNA；所述引物2与RNA单链杂交形成RNA-cDNA，RNA-cDNA在AMV反转录酶的作用下逆转录形成cDNA(互补DNA)，得到带有富C链的DNA；之后引物1又能与带有富C链的DNA杂交两边同时延伸成第二种DNA双链中间体，然后在T7 RNA聚合酶作用下转录出带有RNAG4链的RNA产物，以此循环反应，产生大量的RNAG4；RNAG4可与硫黄素ThT结合，使本身荧光量子产率很低的ThT荧光量子产率急剧增高，通过收集荧光信号实现对HBV DNA的检测。

进一步，所述引物1的核苷酸序列为：

5'-AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAACGGGGTAAAGGTTCAGATATTG-3'(SEQ ID NO.1)。

进一步，所述引物2的核苷酸序列为：

5'-TCCCAACCCGCCCTACCCAAGCAGGCTTTCACTTTCTCGCCAACT-3'(SEQ IDNO.2)。

进一步，所述靶链的核苷酸序列为：

5'-AAGCAGGCTTTCACTTTCTCGCCAACTTACAAGGCCTTTCTGCGTAAACAATATCTGAACCTTTACCCCGTT-3'(SEQ ID NO.3)。