[发明专利]基于体外转录和G4-ThT的荧光传感器及其制备与在HBV DNA检测上的应用

权利要求书

1.一种基于体外转录和G4-ThT的荧光传感器，其特征在于，包括一对引物链、T7 RNA聚合酶、AMV反转录酶和硫黄素ThT，所述引物链包括DNA单链引物1和引物2，所述引物1包括T7序列部分和与靶链互补序列部分，所述引物2包括富C序列部分和与靶链相同序列部分；

所述引物1的核苷酸序列为：

所述引物2的核苷酸序列为：

所述靶链可与引物1的互补序列部分杂交，在AMV反转录酶作用下在引物1和靶链的两端延伸出第一种DNA双链中间体，所述第一种DNA双链中间体包含T7 RNA聚合酶识别位点，可在T7 RNA聚合酶催化作用下体外转录扩增产生大量短单链RNA；所述引物2与RNA单链杂交形成RNA-cDNA，RNA-cDNA在AMV反转录酶的作用下逆转录形成cDNA，得到带有富C链的DNA；之后引物1又能与带有富C链的DNA杂交两边同时延伸成第二种DNA双链中间体，然后在T7 RNA聚合酶作用下转录出带有RNAG4链的RNA产物，以此循环反应，产生大量的RNAG4；RNAG4可与硫黄素ThT结合，使本身荧光量子产率很低的ThT荧光量子产率急剧增高，通过收集荧光信号实现对HBV DNA的检测。

2.根据权利要求1所述的荧光传感器，其特征在于：所述靶链的核苷酸序列为：

3.一对引物链，用于构建HBV DNA的荧光检测体系，其特征在于：所述引物链包括DNA单链引物1和引物2，所述引物1包括T7序列部分和与靶链互补序列部分，所述引物2包括富C序列部分和与靶链相同序列部分；

所述引物1的核苷酸序列为：

所述引物2的核苷酸序列为：

4.根据权利要求1所述的荧光传感器的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：

(1)将DNA单链引物1、引物2、靶链混合，进行预反应，使靶标和引物1预先结合；

(2)加入T7 RNA聚合酶、AMV反转录酶、硫黄素ThT，孵育，进行扩增反应，得荧光检测体系。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中，所述引物1、引物2的摩尔浓度比为1：(0.25-4)；

和/或，所述步骤(1)中，所述靶链的终浓度≥5aM；

和/或，所述步骤(1)中，预反应温度为40-43℃，预反应时间为5-10min。

6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中，还需加入预反应缓冲液、dNTP、NTP，所述预反应缓冲液包括：80mM Tris缓冲液，12mM MgCl₂，70mMKCl，10mM DTT，10％DMSO，pH为8.5。

7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中，用缓冲液将引物1、引物2、靶链分别稀释后，经变性退火后，再混合反应。

8.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中，缓冲液选自TE缓冲液、TBS缓冲液中的至少一种。

9.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中，变性温度为90-100℃，变性时间为5-10min；

和/或，所述步骤(1)中，退火温度为0-5℃，退火时间为8-12min。

10.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中，ThT的终浓度为5-50μM；

和/或，所述步骤(2)中，T7 RNA聚合酶的终浓度为2-4U/μL；

和/或，所述步骤(2)中，AMV反转录酶的终浓度为0.20-0.40U/μL；

和/或，所述步骤(2)中，还需加入核糖核酸酶抑制剂、10×反转录酶缓冲液；

和/或，所述步骤(2)中，孵育温度为40-43℃，孵育时间为80-100min。