[发明专利]一种用于检测路易体病标志物的Cas12a-DNAzyme传感器及其制备方法

说明书

本发明公开了一种用于检测路易体病标志物的Cas12a‑DNAzyme传感器及其制备方法。该传感器包括以下组分：DNAzyme和Locker杂交链D‑L溶液；sub‑1和sub‑2杂交链sub1‑2溶液；发夹H溶液；含LbCas12a、crRNA 1μM和ssDNA‑FQ的报告器溶液；和目标物溶液。该传感器通过核酸适配体与目标α‑syn寡聚体的特异性结合，将非核酸的蛋白目标转换为核酸检测，然后利用基于DNAzyme的步行器和Cas12a的结合，两次放大检测信号，实现了血清中α‑syn寡聚体的灵敏检测。

技术领域

本发明属于生物传感技术领域，具体涉及一种用于检测路易体病标志物的Cas12a-DNAzyme传感器及其制备方法。

背景技术

路易体病是一组异质性疾病，包括帕金森病、帕金森病伴痴呆和痴呆伴路易体病。其病理特征主要是突触前蛋白—α-突触核蛋白（α-synuclein, α-syn）的进行性积聚，因此常被称为突触核病。研究表明α-syn寡聚体为最具致病性的形式，并且在帕金森病患者的脑脊液和血浆中能普遍检测到α-syn寡聚体含量升高。因此，监测α-syn寡聚体的含量变化情况对这些神经退行性疾病的早期诊断具有重大意义。

目前，α-syn寡聚体的临床检测主要依赖于结构和功能磁共振成像、正电子发射断层扫描、原子力显微镜、质谱、毛细管电泳以及酶联免疫吸附法等。这些分析方法通常需要昂贵的仪器设备、复杂耗时的样品预处理以及熟练的操作人员。因此，建立简便、经济的α-syn寡聚体检测方法显得尤为重要。

规律间隔成簇短回文重复序列（Clustered Regularly Interspaced ShortPalindromic Repeats， CRISPR）系统可为细菌提供适应性免疫力，以降解入侵的核酸。在CRISPR-Cas家族中，CRISPR-Cas12a是一种原核生物脱氧核糖核酸酶，可通过RNA引导编程，以靶向互补DNA序列。Cas12a-crRNA复合物在与目标DNA结合后，Cas12a相继以顺位裂解了双链DNA的非目标链和与crRNA杂交的目标链，产生了交错的双链DNA断裂，此过程称之为Cas12a诱导的靶标的顺式切割；此外，Cas12a-crRNA与靶DNA结合形成三元复合体后，还诱导非靶单链DNA的反式切割。Cas12a的这一独特性质已被应用于核酸的检测，并为提高基于核酸诊断应用的特异性、敏感性和速度提供了一种策略。虽然Cas12a在核酸检测领域有了较多应用，但其在蛋白等非核酸目标方面的应用较少报道，有待开拓。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供一种用于检测路易体病标志物的Cas12a-DNAzyme传感器及其制备方法。通过将Cas12a与基于DNAzyme的步行器结合，利用适配体对目标物的特异性识别，实现血清中的路易体病标志物α-syn寡聚体的灵敏检测。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种用于检测路易体病标志物的Cas12a-DNAzyme传感器，包括以下组分：DNAzyme和Locker杂交链D-L溶液；sub-1和sub-2杂交链sub1-2溶液；发夹H溶液；含LbCas12a、crRNA和ssDNA-FQ的报告器溶液；和目标物溶液。

一种用于检测路易体病标志物的Cas12a-DNAzyme传感器的制备方法，包括以下步骤：

（1）将DNAzyme和Locker分别溶于缓冲液B中得到浓度为100 μM的溶液；分别取100μM的DNAzyme和Locker的溶液各1 μL，溶于48 μL的缓冲液B中，混匀后于95 ºC加热5 min，自然冷却至室温，得到DNAzyme和Locker的杂交链D-L溶液，称为混合物1；

（2）将α-syn寡聚体溶于缓冲液A中制备成目标物溶液；向混合物1加入目标物溶液，于37 ºC反应2 h，得到混合物2；