[发明专利]一种用于检测路易体病标志物的Cas12a-DNAzyme传感器及其制备方法

权利要求书

1.一种用于检测路易体病标志物的Cas12a-DNAzyme传感器，其特征在于，包括以下组分：DNAzyme和Locker杂交链D-L溶液；sub-1和sub-2杂交链sub1-2溶液；发夹H溶液；含LbCas12a、crRNA 和ssDNA-FQ的报告器溶液；和目标物溶液；

用于组装Cas12a-DNAzyme传感器的DNA序列包括以下序列：

DNAzyme:5'-GGCGGTACCAGGTCAAAGGTGGGTGAGGGGACGCCAAGAGTCCCCGCGGTTAGATAGACCGTTCGCG-3'；

Locker:5'-GGTGGCTGGAGGGGGCGCGAACGGTCTAT-3'；

Sub-1:5'-TTTGCAGTATCAGTCTATCTAT/rA/GGAAGTACCGCCGTACTGCAAACTGGGTGTGTCGTCTGGTTGGGTG-3'；

Sub-2:5'-TTTGCAGTATCAGTCTATCTAT/rA/GGAAGTACCGCCGTACTGCAAACGACCAACCCAGCACCCAACCAGA-3'；

发夹H:5'-ATCAGTCTATGCAATAGATAGACTGATACTGCAAA-3'；

ssDNA-FQ:5'-Cy3-TTATT-BHQ2-3'；

所述crRNA序列为：5'-UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUCAGUAUCAGUCUAUCUAU-3'。

2.如权利要求1所述一种用于检测路易体病标志物的Cas12a-DNAzyme传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）将DNAzyme和Locker分别溶于缓冲液B中得到终浓度为100μM的溶液；分别取100μM的DNAzyme和Locker的溶液各1μL，溶于48 μL的缓冲液B中，混匀后于95 ºC加热5 min，自然冷却至室温，得到DNAzyme和Locker的杂交链D-L溶液，称为混合物1；

（2）将α-syn寡聚体溶于缓冲液A中制备成目标物溶液；向混合物1加入目标物溶液，于37 ºC反应2 h，得到混合物2；

（3）将sub-1和sub-2分别溶于缓冲液B中得到浓度为100 μM的溶液；将sub-1溶液和sub-2溶液分别于95 ºC加热5 min，自然冷却至室温；然后取退火后的100 μM的sub-1溶液和sub-2溶液各1 μL，溶于48 μL的缓冲液B中，混匀后在室温反应2 h，得到sub-1和sub-2的杂交链sub1-2溶液，称为混合物3；

（4）将发夹H溶于缓冲液B中得到浓度为100 μM的溶液；将2 μM的发夹H经95 ºC加热5min并自然冷却至室温；分别取10 μL退火后的2 μM发夹H、混合物2、混合物3，混匀后于30 ºC反应2 h，得到含有目标物的混合物4；

（5）各取10 μL浓度均为500 nM的LbCas12a和crRNA混匀，25 ºC反应30 min，再加入50μL的浓度为1 μM的ssDNA-FQ，混匀后得到报告器溶液；

（6）将70 μL的报告器溶液和30 μL的混合物4混匀后于37 ºC避光反应2 h，得到总体积为100 μL的待测溶液；在525 nm的激发光波长下测量并记录样品在540−650 nm范围内的荧光强度。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述缓冲液A成分为：0.24% Tris-0.87% NaCl，pH = 7.4，0.2 μm滤膜过滤；缓冲液B成分为：200 mM NaCl，100 mM Tris-HCl，pH = 7.4。