[发明专利]一种编码分泌性野生型GAA蛋白的核苷酸组合物、腺相关病毒载体及其药物和应用

说明书

本发明公开了一种编码分泌性野生型GAA蛋白的核苷酸组合物、腺相关病毒载体及其药物。该核苷酸包括如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。本申请通过以腺相关病毒(AAV)为载体将目的基因导入细胞内，达到细胞持续表达并分泌野生型GAA的目的，本申请设计并制备重组腺相关病毒(rAAV)，通过rAAV一次性感染患者的骨骼肌细胞，在肌细胞内持续表达并分泌野生型GAA，达到持续升高体内野生型GAA的目的，从根本上解决了重组GAA酶替代治疗在血液中半衰期短和需要终身治疗的缺点。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种编码分泌性野生型GAA蛋白的核苷酸组合物、腺相关病毒载体及其药物和应用。

背景技术

糖原累积病Ⅱ型又称Pompe病，由荷兰病理学家Pompe在1932年首次报道，是一种罕见的常染色体隐性遗传病，是由于酸性α-葡萄糖苷酶(GAA)基因缺陷所致。GAA是溶酶体中糖原降解所必需的酶，能够使低聚糖和糖原分解成葡萄糖。该酶活性降低时，糖原不能分解，导致溶酶体内糖原蓄积引起溶酶体的破裂，溶酶体是分解蛋白质、核酸、多糖等生物大分子的细胞器，内含许多水解酶，如果溶酶体破裂，释放的水解酶可破坏细胞，导致细胞死亡，从而引起骨骼肌、心肌、肝脏等组织损伤。临床可表现为肌肉无力、心肌肥大、心功能不全等症状，严重者可因呼吸循环衰竭而死亡。

GAA基因定位于17q25.2-q25.3，全长约28kb，包括20个外显子；其中1号外显子不参与编码蛋白，cDNA全长约3.6kb，GAA蛋白是由952个氨基酸组成。至今，已经发现了GAA基因的近300种致病突变，突变位置主要集中在基因的3个功能区域。致病突变主要导致GAA不同程度的活性丧失，GAA活性越低，发病年龄越早，临床表现越严重。

目前，人重组酸性α-葡萄糖苷酶(rhGAA)替代疗法是能够有效治疗糖原累积症II型的唯一疗法。赛诺菲公司开发的rhGAA(品牌名：Lumizyme)于2014年8月获FDA批准上市，该疗法需患者每1周静脉输注一次rhGAA酶(Lumizyme 20mg/kg)。rhGAA虽然疗效显著，但病人需要终身治疗，并且费用昂贵(50万人民币/年)，绝大多数患者家庭难以承受，而且由于rhGAA是一种有活性的酶，其保存，运输，以及使用(1mg/kg/hr，一次静脉注射需要20小时)均有严格要求，且还存在rhGAA对骨骼肌的靶向性较差、机体对外源蛋白质的免疫排斥反应等缺点而影响疗效。因此，研发一种安全长效、持续稳定的给患者提供有活性的GAA是治疗GSDⅡ的迫切临床需要。

安全高效地将目的基因导入人体靶细胞是成功进行基因治疗的关键之一。经典的基因导入方式(显微注射、电穿孔、磷酸钙转染等)虽然曾在科研中起了一定的作用，但由于不能很好地解决转染率、靶向性、安全性等问题而限制了它们的应用。随着病毒学等相关学科的发展，目前基因治疗已广泛使用各种病毒作载体，腺相关病毒(AAV)载体就是最近二十年发展起来的一类新型载体。作为病毒载体的重要一员，AAV无明显的细胞毒性效应，并且不会像其他病毒载体那样引起细胞强烈的免疫反应，因而其在基因治疗中的应用潜力引起了人们越来越多的兴趣和关注，目前唯一可用于人类的以AAV为载体的人类基因治疗药物已经开始面世。

Abigail Wexner研究所基因治疗中心的首席研究员Jerry Mendell医学博士在基因治疗脊髓性肌萎缩症1型(SMA1)(两岁内必须终身使用呼吸机维持生命)症状的第一次临床试验中，给与带突变的SMA1基因(the SMNgene)的患儿静脉注射Zolgensma(改良腺相关病毒血清型9(AAV9)为载体能够导入人野生型SMN基因功能)传递给患者细胞。研究中几乎所有接受一次性静脉注射高剂量的患者运动功能快速提高，不用其他药物实现了与儿童运动发育相关的主要里程碑，包括吞咽、翻滚、独立坐、跑和跳，进一步验证了以AAV作为载体的人类基因治疗药物是切实可行的。