[发明专利]一种免扩增核酸检测方法

说明书

本发明涉及一种免扩增核酸检测方法，该方法包括以下步骤：1)通过在金膜表面进行修饰得到的免扩增核酸检测传感芯片；2)以金纳米颗粒作为报告分子与待检测样品，加入所述免扩增核酸检测传感芯片的反应腔；3)通过波矢耦合搭建的具有无标记实时监测能力的表面等离子共振成像系统SPRi，实现对核酸的免扩增单颗粒检测。与现有技术相比，本发明通过对单分子杂交过程的动态检测和数字化分析，极大提高核酸检测的灵敏度，解决了核酸扩增易受气溶胶污染、假阳性高的问题。

技术领域

本发明属于生物传感器领域，涉及一种基于表面等离子共振显微成像技术的免扩增核酸检测方法。

背景技术

分子诊断技术相较于其他技术具有快速、高灵敏、高特异性等优势，是体外诊断技术最重要的发展和研究方向。核酸检测作为分子诊断技术的一项重要应用发挥着越来越重要的作用，截至2020年12月3日，中国国家药品监督管理局已批准的53个新冠病毒检测试剂中就包含25个核酸检测试剂，可见核酸的单分子检测仍是目前应用最广，实用性最高的技术。如何提高核酸分子检测的速度、灵敏度和特异性，是提高重大疾病诊断能力的重点和难点问题。

目前的核酸检测技术多采用靶标扩增(target-amplification)的策略来实现对待测核酸分子的超灵敏检测。其本质是一种终点检测，即将待测分子与试剂(酶，引物和底物等)充分反应后对扩增后的核酸分子进行信号检测，灵敏度和特异性均受分子结合动力学的限制。如图1所示，Ligand/Target molecule为配体目标分子，Receptor为受体，Non-specific binding为非特异性结合的分子，specific binding为特异性结合的分子，在分子杂交或免疫反应达到平衡状态时，发生结合的分子数取决于可结合位点数、样品浓度以及亲和力，因此当样品浓度降低到一定程度时，发生结合的分子数将不足1个，即使采用最先进的单分子检测技术，也将无法稳定检测到信号。该临界浓度即理论灵敏度极限，通常在100fM量级，同时由于背景噪声的存在无法达到单分子检测，导致在实际应用中的检测限通常在pM或pg/mL级，无法对更低丰度的重要生物分子进行检测。另一方面，虽然通常情况下特异性结合的亲和力要远高于非特异性结合，但在实际检测中，样品中干扰分子的浓度通常远高于待测分子，使得平衡状态下非特异性结合的分子数量变得不可忽略，造成假阳性结果。因此，在核酸检测中，首先需要采用聚合酶链式反应PCR技术进行核酸扩增，将样品浓度提高，通过荧光强度变化检测产物浓度的变化，这通常需要长时间的核酸提取和扩增步骤，如在新冠病毒检测中，核酸检测通常需要数个小时才能得到结果。从原理上来说，PCR技术并没有突破分子结合动力学的限制，也无法解决特异性的问题。最后，基于扩增策略还存在一个不容忽视的问题-气溶胶污染，PCR技术的高扩增效率产生的核酸气溶胶污染，会导致检测结果的假阳性，样本和扩增产物经常出现多批次相同的情况，核酸气溶胶污染在实验区域内不断累积，日积月累从而导致污染风险不断增加，假阳性的发生频率也越来越高。因此，开发一种无扩增的超灵敏的核酸检测装置成了分子诊断领域的一个迫切需要解决的问题。

发明内容

本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种突破终点检测极限实现超灵敏检测，无需扩增，大大缩短检测时间且从根本上解决了气溶胶污染的免扩增核酸检测方法。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：一种免扩增核酸检测方法，该方法包括以下步骤：

1)通过在金膜表面进行修饰得到的免扩增核酸检测传感芯片；

2)以金纳米颗粒作为报告分子与待检测样品，加入所述免扩增核酸检测传感芯片的反应腔；

3)通过波矢耦合搭建的具有无标记实时监测能力的表面等离子共振成像系统SPRi，实现对核酸的免扩增单颗粒检测。

进一步地，所述的免扩增核酸检测传感芯片通过以下方法获得：

a)在光学玻璃上利用磁控溅射法先镀3～9nm的铬Cr，再镀27～61nm的金Au，得到30～70nm厚度的镀膜表面；