[发明专利]一种免扩增核酸检测方法

权利要求书

1.一种免扩增核酸检测方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

1)通过在金膜表面进行修饰得到的免扩增核酸检测传感芯片；

2)以金纳米颗粒作为报告分子与待检测样品，加入所述免扩增核酸检测传感芯片的反应腔；

3)通过波矢耦合搭建的具有无标记实时监测能力的表面等离子共振成像系统SPRi，实现对核酸的免扩增单颗粒检测；

所述方法为非疾病的诊断方法；

所述的免扩增核酸检测传感芯片通过以下方法获得：

a)在光学玻璃上利用磁控溅射法先镀3～9nm的铬Cr，再镀27～61nm的金Au，得到30～70nm厚度的镀膜表面；

b)将步骤a)得到的镀有金膜的玻片用食人鱼洗液冲洗吹干，接着用氢焰处理，除去表面颗粒杂质同时进一步提升金膜平整度；

c)将步骤b)得到的芯片与微流控检测腔结合，并对芯片的金片表面进行修饰即得免扩增核酸检测传感芯片；

所述的微流控检测腔为带有孔的聚二甲基硅氧烷PDMS板，PDMS板上的预设孔即是反应检测腔室；

芯片与微流控检测腔结合是将微流控检测腔固定在芯片的金片表面；

对芯片的金片表面进行修饰的方法如下：

i)先在微流控检测腔的腔室加入浓度为10nM～1uM钝化分子，孵育30s～2min钝化金表面，之后用1xPBS清洗；

ii)加入含有捕获分子的溶液，浓度为10nM～500nM，孵育2～8h；

iii)孵育完成后移去溶液，用稀释20～100倍的PBS溶液清洗，再用钝化分子孵育15～60min以减少非特异吸附；

iv)用PBS清洗以移除多余的化合物，所得芯片储存在4℃冰箱；

所述的钝化分子为一段巯基修饰或进行了抑制非特异吸附的功能化的分子，包括巯基聚乙二醇(mPEG-SH)、或巯基乙醇(MCH)；

所述的捕获分子为长度x取值范围为17～150的ssDNA；

所述的免扩增核酸检测传感芯片在检测过程中构建了夹心(sandwich)结构实现单颗粒检测，其中：

下方是修饰在免扩增核酸检测传感芯片金膜表面的捕获分子，为长度x，取值范围为17～150的ssDNA；金膜表面除了捕获分子外还有钝化分子用来抑制非特异性吸附，两者的比例在1：100～1:1000之间；

中间是目标分子，是单链核酸ssDNA、微小核酸microRNA(miRNA)、信使RNA(mRNA、lncRNA)或循环核酸；

上方是跟目标分子特异性结合的核酸作为检测分子，检测分子为ssDNA，其长度为y，取值范围为50～200；检测分子与报告分子紧密结合，通过报告分子实现对信号的放大；

报告分子是粒径在30～2000nm的纳米颗粒，材质为二氧化硅、金、银或聚苯乙烯PS；

所述的捕获分子与目标分子核酸的碱基互补链长为15～200nt，结合常数k_on≥10⁶M^-1s^-1，解离常数k_off≤0.001s^-1；解离平衡常数K_D≤1nM；标准情况下的分子结合自由能≤-27kcal/mol，熔解温度T_m≤47℃；

所述的检测分子与目标分子核酸的碱基互补链长为10～15nt，结合常数k_on≥10⁵M^-1s^-1，解离常数k_off≥0.1s^-1；解离平衡常数K_D≤1μM；标准情况下的分子结合自由能≥-17kcal/mol，熔解温度T_m≤20℃。

2.根据权利要求1所述的一种免扩增核酸检测方法，其特征在于，用于构建表面等离子成像系统的显微镜是物镜型SPRM、Kretschmann结构的棱镜型SPRM、宽场照明型SPRM，或扫描型SPRM。