[发明专利]一种酶活提高及最适pH改变的天冬氨酸酶突变体

说明书

本发明提供了一种酶活提高及最适pH改变的天冬氨酸酶突变体，属于基因工程技术领域；所述天冬氨酸酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明的天冬氨酸酶突变体是在来源于Bacillus sp.YM55‑1天冬氨酸酶的基础上，将第12位亮氨酸突变为天冬氨酸，将第166位酪氨酸突变为谷氨酸，将第169位谷氨酰胺突变为谷氨酸，将第314位精氨酸突变为甲硫氨酸，从而提升了该酶的pH适应性，同时增强了该酶合成β‑氨基丁酸的能力，有利于工业化生产β‑氨基丁酸。

技术领域

本发明涉及一种酶活提高及最适pH改变的天冬氨酸酶突变体，属于基因工程技术领域。

背景技术

β-氨基酸在制药工业上是广泛应用的靶分子，是生物活性化合物或天然产物和药物的结构单元。其中β-氨基丁酸是一种有效的引发剂，可在至少40种植物物种中提供广谱性疾病保护。另外β-氨基丁酸可以作为医药中间体β-氨基丁醇的前体物质，该物质是抗肿瘤药物4-甲基环磷酰胺、青霉烯类抗生素以及治疗艾滋病整合酶抑制药物杜鲁特韦(Dolutegravir)的关键中间体。

天冬氨酸酶的天然底物是天冬氨酸，以高底物特异性和二级羧酸盐结合口袋的特性被选择改造用于β-氨基酸的制备。但目前的天冬氨酸酶对反应的pH值条件要求苛刻，依赖高温强碱的反应环境，在温和条件下酶活较低，这一缺陷导致β-氨基酸生产成本较高。

发明内容

本发明的目的在于提供一种天冬氨酸酶突变体、包含天冬氨酸酶突变体的重组表达载体和重组菌及应用，本发明的天冬氨酸酶突变体在温和条件下的酶活提高，能够提高制备β-氨基酸的反应效率，同时降低反应成本。

本发明将天冬氨酸酶第12位亮氨酸突变为天冬氨酸，将第166位酪氨酸突变为谷氨酸，将第169位谷氨酰胺突变为谷氨酸，将第314位精氨酸突变为甲硫氨酸。本发明通过改造天冬氨酸酶表面电荷，改变了酶的构象状态，有利于酶调整柔性结构并呈现新的pH活性，加强了该酶合成β-氨基丁酸的能力。

本发明提供了一种天冬氨酸酶突变体，所述天冬氨酸突变体包含如SEQ ID NO.1所示的氨基酸。

本发明提供了编码所述天冬氨酸突变体的基因。

在一种实施方式中，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明提供了携带所述基因的重组质粒。

在一种实施方式中，所述重组质粒以pET系列载体作为出发载体。

本发明提供了表达所述突变体，或携带所述重组质粒的微生物细胞。

在一种实施方式中，所述微生物细胞以大肠杆菌作为宿主细胞。

本发明提供了一种生产β-氨基丁酸的方法，利用所述微生物细胞转化巴豆酸生产β-氨基丁酸。

在一种实施方式中，将所述微生物细胞加入反应体系，使得微生物细胞在反应体系中的OD₆₀₀为40-60，并维持反应体系中巴豆酸含量不低于80g/L。

在一种实施方式中，在40-60℃下反应时间不少于8h。

本发明提供了所述天冬氨酸酶突变体，或所述基因，或所述重组菌在制备β-氨基酸以及衍生产品中的应用。

本发明的有益效果：