[发明专利]一种基于邻位连接的检测RNA病毒高级结构的方法

说明书

本发明提供了一种基于邻位连接的检测RNA病毒高级结构的方法，属于病毒检测技术领域。检测RNA病毒高级结构的方法是将RNA病毒与交联剂混合，在紫外光下交联，回收RNA病毒；提取交联RNA病毒的RNA，用RNaseⅢ进行片段化处理，将RNA片段连接后解交联，将解交联的RNA片段建立测序文库；将测序文库进行高通量测序，对测序结果进行RNA高级结构分析。本发明利用高效的近距离连接反应，可以实现细胞培养或者收集的上清病毒颗粒内进行RNA病毒基因组高级结构解析。同时所述方法适用于起始量低至200ng的总RNA的样品进行实验。本发明提供的方法能大大提高近距离连接反应应用在病毒等微量RNA结构研究的适用性。

技术领域

本发明属于病毒检测技术领域，具体一种基于邻位连接的检测RNA病毒高级结构的方法。

背景技术

病毒是目前发现的最简单的生命体。除朊病毒以外，病毒由核酸和蛋白组成。根据病毒的核酸类型，分为RNA病毒和DNA病毒。完整的病毒核酸也称为病毒基因组。病毒基因组是病毒的全套遗传密码，指导所有病毒蛋白的翻译，并调控病毒生命周期。近年来研究表明病毒基因组结构不仅具有编码病毒蛋白的功能，其片段间可以相互折叠，形成复杂的空间结构。而这种空间(高级)结构对于病毒基因编码、病毒感染复制都具有重要的意义。因此，研究病毒的基因组的高级结构对于理解病毒的致病性和感染与复制的过程具有重要的意义。

理论上，细胞内RNA或者DNA高级结构的鉴定方法适用于病毒基因组结构的研究。目前，研究细胞内RNA高级结构的技术大体可分为如下几类：X-ray、NMR、点击化学方法和现有邻位连接法。其中X-ray和NMR均具有分辨率高的特点，但也存在技术复杂，不能研究生理条件下RNA结构的缺陷，适用于精细判断RNA复合体结构。点击化学方法具有简便、高通量的特点，但只能判断RNA是否是双链，不能判定互作关系，适于细胞内RNA结构预测。现有邻位连接法虽然适用于细胞内RNA结构及互作，也具有高通量、生理条件下RNA结构绘制的特点，但存在操作步骤复杂，对样本要求较高的缺陷，不适用于研究低含量的病毒样本。

研究RNA高级结构，根本在于研究RNA分子内局部片段间空间接触或相互作用的频率。为解决上述问题，近年来研究者发展出一系列研究技术，基本思想是利用RNA交联剂将相互靠近(相互作用)的RNA固定，再对RNA末端进行处理并连接相互作用的RNA片段，并通过高通量测序和生物信息学分析鉴定“嵌合”RNA的发生频率来判断RNA片段的相互作用关系。这些研究方法自从早期发明以来为不同的生理条件下研究鉴定RNA结构和相互作用发挥了重要的作用。前期公开的论文中所有的方法都包含富集交联片段，这就对起始样本量提出了很高的要求。通常需要至少20μg的总RNA才能满足实验需求。但相对于细胞内RNA，病毒基因组存在如下特点：病毒基因组拷贝数可能较低，总的病毒核酸量很低；病毒基因组占全部宿主基因数数量很低。因此，常规的RNA结构的研究策略在研究病毒基因组结构时存在诸多困难。特别是很难满足实验所需要的病毒核酸量，导致分析覆盖度不够，进而导致大量结构细节丢失。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种基于邻位连接的检测RNA病毒高级结构的方法，能够实现对低浓度的病毒样本进行RNA病毒基因组高级结构解析，并且所得高级结构信息较为全面。

本发明提供了一种基于邻位连接的检测RNA病毒高级结构的方法，包括以下步骤：

1)将RNA病毒与交联剂混合，在紫外光下交联，回收RNA病毒，得到交联的RNA病毒；

2)提取步骤1)中所述交联的RNA病毒的RNA；

3)将步骤2)中所述RNA用RNaseⅢ进行片段化处理，得到RNA片段；

4)将步骤3)中所述RNA片段连接后解交联，得到解交联的RNA片段；

5)将所述解交联的RNA片段建立测序文库；

6)将步骤5)中所述测序文库进行高通量测序，对测序结果进行RNA高级结构分析。