[发明专利]一种利用qPCR技术检测绵羊FecB基因多态性的引物组及其方法

说明书

本发明公开了一种利用qPCR技术检测绵羊FecB基因多态性的引物组及其方法。所述的引物组由引物对1和引物对2组成，其中，引物对1的下游引物3’端和++型的基因位点相匹配；引物对2的下游引物的3’端和BB型的基因位点相匹配。将待测样品分别用引物对1和引物对2进行qPCR扩增，扩增结束后根据两个荧光信号达到阈值的顺序即可判断出FecB基因型。该方法与传统的PCR‑Sanger测序及Taqman探针方法检测相比，节省检测成本、缩短检测周期和提高检测精准性。本发明提供的方法能快速有效地检测出绵羊FecB的BB基因型，为从大群体中筛选出产羔率更高的FecB的BB基因型亲本提供了一种简便易行、廉价有效的方法。

技术领域

本发明涉及一种检测绵羊FecB基因多态性的引物组及其方法，特别涉及一 种利用qPCR技术检测绵羊FecB基因多态性的引物组及其方法。本发明属于分 子生物学辅助育种领域。

背景技术

绵羊产羔数是一个极其复杂的性状，受诸多因素影响。目前，国内外学者已 对影响绵羊产羔数的众多候选基因进行了深入研究，已定位的主要基因包括骨形 态发生蛋白受体1B(Bone morphogenetic protein receptor 1B，BMPR1B，FecB)、 骨形态发生蛋白15(Bone morpho-genetic protein 15，BMP15，FecX)、生长分 化因子9基因(Growthdifferentiation factor-9，GDF9，FecG)和糖基化酶β-1， 4-N-乙酰半乳糖胺转移酶2(Glycosylation enzymebeta-1, 4-N-acetyl-galactosaminyltransferase2，B4GA-LNT2，FecL)等，这些基因在调控 绵羊产羔性状方面起到至关重要的作用。目前全世界仅有少数绵羊品种产羔率能 达200％，大多数绵羊属于季节性发情、单羔品种。同时绵羊产羔性状的遗传力 较低(仅为0.1左右)。

研究表明，FecB基因(BMPR-1B)编码区第746位碱基发生A-G的突变， 导致第249位氨基酸由谷氨酰胺变为精氨酸(Q249R)，降低了其对配体BMP4 和GDF5的敏感性，进而高浓度的GDF5抑制孕酮分泌，促使排卵数增加。FecB 基因是第一个被发现的绵羊高繁殖力主效基因，与绵羊排卵数和产羔数紧密相关。 一个FecB基因拷贝可以增加排卵数1.3～1.6枚，产羔数增加0.9～1.2只；两个FecB 基因拷贝可以增加排卵数2.73枚，产羔数增加1.1～1.7只。继布鲁拉羊中发现FecB 基因之后，进一步的研究发现，在亚洲绵羊品种中FecB基因的分布较为广泛。 在印度绵羊品种Kendrapada、Garole和Bonpala，印度尼西亚Javenese羊，中国 的小尾寒羊等绵羊品种中均存在该基因。Chen等利用FecB基因效应，使用小尾 寒羊和杜泊羊进行杂交培育多羔新品系，杂交后代平均产羔数显著高于杜泊羊(P0.05)。

目前常用的检测FecB基因多态性的常用方法包括PCR-Sanger测序、 PCR-RFLP、PCR-SSCP、Taqman MGB探针及ELISA等方法。PCR-Sanger技术 准确率高，但价格昂贵，且Sanger测序需要一定的时间周期，相对而言速度较慢。 PCR-RFLP、PCR-SSCP及ELISA技术程序繁琐、通量低。PCR-RFLP技术引入 了限制性内切酶，在实际操作中限制性内切酶在工作中易因为切割条件的变化出 现星活性，故假阳性率相对较高。PCR-SSCP分析技术需要对PCR产物进行变性 处理后于不含变性剂的中性聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳。变性后单链DNA形成 不同的二级结构，其在电泳中的迁移速率不同，但该方法对电泳条件要求较为严苛，同时PCR产物中其他位置的突变会对目标突变的判断产生干扰，准确率相 对较低。Taqman MGB探针法准确率高，但成本也高，不适用于大规模的检测。 ELISA的方法需要制备或购买相对应的单克隆抗体，检测过程繁琐，假阳性率高， BB型个体的检出率仅能达到96％左右，且不能很好的鉴别杂合性个体与BB型 个体。

因此，找到一种简便宜行、廉价有效鉴定FecB的不同基因型(BB型、B+ 型和++型)的方法极其重要，不仅能够筛选出高繁绵羊群体，而且能够极大提高 了养羊业的经济效益。