[发明专利]一种制备高纯度乳铁蛋白的方法

说明书

本发明涉及一种制备高纯度乳铁蛋白的方法，其包括以下步骤：(1)将脱脂液体乳进行预处理；(2)将经过预处理的脱脂液体乳进行第一阳离子交换层析，其中上样流速为500～1000cm/h，洗杂盐溶液为浓度0.3～0.45M的金属卤化物水溶液，得到乳铁蛋白溶液；(3)将乳铁蛋白溶液进行超滤脱盐或稀释；(4)然后将经过超滤脱盐或稀释的乳铁蛋白溶液进行第二阳离子交换层析，其中上样流速为50～400cm/h，洗杂盐溶液为浓度0.35～0.55M的金属卤化物水溶液，得到乳铁蛋白纯度不低于95％的乳铁蛋白溶液；(5)将高纯度乳铁蛋白溶液进行超滤浓缩和脱盐，得到乳铁蛋白原液。根据本发明，实现了规模化、低成本制备符合食品安全国家标准GB1903.17‑2016，同时乳铁蛋白回收率不低于62.5％的高纯度乳铁蛋白的方法。

技术领域

本发明属于乳制品加工技术领域，其涉及一种高纯度乳铁蛋白的规模化生产技术，特别是以牛/羊乳、初乳或乳清为原材料，每批次制备公斤级以上符合国家标准GB1903.17-2016质量要求的高纯度乳铁蛋白产品的方法。

背景技术

乳铁蛋白(Lactoferrin)是动物乳中的天然蛋白质，具有广谱抗菌、抗病毒感染、调节体内铁的平衡、调节机体免疫功能、抑制人体肿瘤细胞生长的作用。婴幼儿配方奶粉主要采用牛乳作为配方的基础，但人乳中乳铁蛋白浓度约为1.0～3.0mg/mL，是牛乳中的10倍(牛乳中含量为0.02～0.35mg/mL)，因此婴幼儿配方奶粉中需要额外添加乳铁蛋白，以使配方组成和功能更接近于人乳。因此，奶粉行业存在规模化使用乳铁蛋白的实际需求。

2016年12月，我国卫计委和食药监总局联合发布了关于营养强化剂-乳铁蛋白的食品安全国家标准GB1903.17-2016，其中对食品营养强化剂乳铁蛋白的理化指标以及检测方法提出明确的要求：乳铁蛋白占总蛋白质量百分比(w/％)≥95％，纯度检测方法为使用C4反相分析柱在高效液相色谱仪上进行分析。由此可见，出于对食品安全和产品质量的高标准要求，需要开发规模化制备高纯度乳铁蛋白的方法。

目前已经能够使用阳离子交换层析、疏水层析、亲和层析、电分离、交叉流过滤等技术互相配合，从乳、初乳或乳清中制备得到乳铁蛋白。由于乳铁蛋白和乳过氧化物酶是乳中少数带有正电荷的蛋白质分子，乳中其它蛋白和小分子物质主要带负电荷或电中性。因此，乳、初乳或乳清经过阳离子交换层析柱时，乳铁蛋白或乳过氧化物酶依靠和层析介质之间异性电荷相互吸引结合到层析介质上。由于这两种蛋白所带电荷量不同，乳过氧化物酶在阳离子交换层析介质上的结合比乳铁蛋白弱。通过低浓度的NaCl或KCl溶液，可先将乳过氧化物酶洗脱下来，进一步提高NaCl或KCl溶液的浓度，可洗脱得到纯化的乳铁蛋白溶液。由于阳离子交换层析具有分辨率高、结合载量大、成本低、易于放大等优势，成为工业化生产乳铁蛋白的主流技术。

中国专利CN104926936A公布了一种使用阳离子交换树脂纯化乳铁蛋白的方法，液体乳平均粒径D90为1微米以下，所述液体乳在离子交换柱中保留时间为6～8分钟，第一洗脱液为25～35质量％的NaCl溶液，第二洗脱液为75～100质量％的NaCl溶液。第二洗脱液经过膜浓缩和脱盐，得到乳铁蛋白。在实际规模化生产中，液体乳在层析柱中的保留时间(对应于本发明的第一步阳离子交换层析的保留时间)超过4分钟，并不能明显提高树脂对蛋白的吸附能力，反而大幅降低了层析步骤的生产效率，增加了未进行巴氏杀菌的液体乳中微生物大量滋长的风险。并且此文献披露的第一步洗脱液25质量％浓度对应的NaCl摩尔浓度为4.2mol/L，此浓度明显过高，将会把所有结合在树脂上的蛋白一起洗脱下来，无法实现蛋白分级纯化的目的。此文献所述方法制备的乳铁蛋白纯度为90～95％(根据食品安全国家标准GB1903.17-2016检测纯度约为84～89％之间)，未达到GB1903.17-2016乳铁蛋白占总蛋白质量百分比(w/％)≥95％的要求。