[发明专利]一种依替米星酶联免疫测定方法

说明书

本发明涉及一种依替米星酶联免疫测定方法，所述方法，包括使用两种不同种属的特异性依替米星单克隆抗体，命名为抗体1，抗体2，其中，将抗体1固化到载体，抗体2进行辣根过氧化物酶标记，然后利用标准曲线对依替米星含量进行检测。

技术领域

本发明涉及一种药物检测方法，特别涉及一种依替米星酶联免疫吸附测定方法，具体涉及一种基于固化的依替米星抗体、加入依替米星和辣根过氧化物酶标记的依替米星抗体，通过双抗夹心酶联免疫法测定依替米星含量。

背景技术

依替米星(etimicin sulfate)，又名爱大霉素，是一种新的半合成水溶性氨基糖苷类抗生素，对静止期细菌的杀灭作用强，其作用机制是抑制敏感菌正常的蛋白质合成。

依替米星因为只有紫外末端吸收难以用紫外检测器进行测定，目前较普遍的为通过采用通用型检测器如示差折光检测器和蒸发光散射检测器或采用离子色谱仪电化学检测方法检测依替米星的含量。

酶联免疫分析技术的基本原理就是利用酶标记的抗原或抗体之间的反应，通过酶作用底物的显色以对抗体或抗原进行分析。目前还没有见到利用酶联免疫分析技术进行依替米星含量检测的报道。

采用精密仪器(如液相色谱仪等)在依替米星含量测定上有一定的优势，但由于仪器设备价格昂贵、维护成本较高、检测周期较长，对检测人员的要求较高，因此开发一种操作方便、用时较短、重现性好的检测方法对于依替米星的生产研究和工艺开发都有非常积极的意义。

本发明通过酶联免疫吸附测定方法检测依替米星的含量，具有安全准确、成本较低、测定周期较短、重现性好、一次性检测样本量大等特点。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于提供一种依替米星的含量测定方法，采用双抗体夹心酶联免疫方法，方法中包括使用两种不同种属的特异性依替米星单克隆抗体，命名为抗体1，抗体2，其中，将抗体1固化到载体，抗体2进行辣根过氧化物酶标记，然后利用标准曲线对依替米星含量进行检测。

优选的，本发明所述方法，包括以下步骤：

步骤1，待测样品的配制：依替米星原料药或依替米星注射液，经超纯水溶解或稀释成依替米星终浓度为10μg/mL～30μg/mL；

步骤2，依替米星抗体1包被：取依替米星抗体1，包被于固相载体上；

步骤3，将标准品、待测样品、辣根过氧化物酶标记的抗体2，和步骤2的包被抗体1混合，进行免疫显色反应；

步骤4，将终止液与步骤3的显色液混合，终止反应；

步骤5，用分光光度计测定显色反应液的吸光度，根据标准曲线，计算待测样品中依替米星的含量。

其中，所述依替米星为以下产品：含有依替米星的原料药，包括硫酸依替米星，依替米星，盐酸依替米星，含有依替米星的药物制剂，包括硫酸依替米星注射剂，硫酸依替米星氯化钠注射液，依替米星注射剂，盐酸依替米星注射剂，以及任何一种可供服用的制剂形式，如片剂，胶囊剂，口服液，颗粒剂等。

本发明制备了两个不同种属的特异性依替米星单克隆抗体，依替米星抗体1和抗体2。制备方法包括以下步骤：将依替米星偶联血蓝蛋白，与佐剂混合，注射入两种动物体(选自：小鼠，兔，羊)内，1周后再次注入，3周后再次注入，取动物脾细胞，进行细胞融合、筛选和亚克隆。将筛选后的亚克隆细胞柱注入动物腹腔，收集腹水，进行 SDS-PAGE及ELISA鉴定，并利用亲和层析对其进行纯化，得到两个不同属源的依替米星单克隆抗体，分别称为抗体1，抗体2(1和2 编号可以任意安排，如，将小鼠抗体命名为抗体1，则另一个兔或羊的抗体则命名为抗体2，反之也可以，目的是将两种不同种属的抗体区别开)。通过将一个种属的特异性抗体固化到载体，另一个不同种属的抗体进行辣根过氧化物酶标记，利用双抗体夹心酶联免疫方法进行依替米星含量的检测。