[发明专利]一种依替米星酶联免疫测定方法

权利要求书

1.一种依替米星含量测定方法，所述方法，采用双抗体夹心酶联免疫方法，方法中包括使用两种不同种属的特异性依替米星单克隆抗体，命名为抗体1，抗体2，其中，将抗体1固化到载体，抗体2进行辣根过氧化物酶标记，然后利用标准曲线对依替米星含量进行检测。

2.根据权利要求1所述的方法，包括以下步骤：

步骤1，待测样品的配制：依替米星原料药或依替米星注射液，经超纯水溶解或稀释成依替米星终浓度为10μg/mL～30μg/mL；

步骤2，依替米星抗体1包被：取依替米星抗体1，包被于固相载体上；

步骤3，将标准品、待测样品、辣根过氧化物酶标记的抗体2，和步骤2的包被抗体1混合，进行免疫显色反应；

步骤4，将终止液与步骤3的显色液混合，终止反应；

步骤5，用分光光度计测定显色反应液的吸光度，根据标准曲线，计算待测样品中依替米星的含量。

3.根据权利要求1所述的方法，其中，依替米星抗体1和抗体2的制备方法包括以下步骤：将依替米星偶联血蓝蛋白，与佐剂混合，注射入两种动物体内，1周后再次注入，3周后再次注入，取动物脾细胞，进行细胞融合、筛选和亚克隆。将筛选后的亚克隆细胞柱注入动物腹腔，收集腹水，进行SDS-PAGE及ELISA鉴定，并利用亲和层析对其进行纯化，得到两个不同属源的依替米星单克隆抗体，分别称为抗体1，抗体2。

4.根据权利要求1所述的方法，其中，依替米星抗体包被的方法是用包被缓冲液将鼠源依替米星抗体按需要稀释，向酶标板微孔中加入抗体稀释液，放入4℃环境中过夜孵育；倾去包被液，用洗涤液洗涤，在每孔中加入封闭液，37℃孵育；倾去孔内液体，干燥后用铝膜真空密封保存。

5.根据权利要求1所述的方法，其中，所述辣根过氧化物酶标记依替米星抗体，制备方法为过碘酸钠法。

6.根据权利要求1所述的方法，其中，固相载体选自：聚苯乙烯、硝酸纤维素、聚乙烯、聚丙烯、聚丙烯酰胺、交联葡萄糖、玻璃、硅橡胶、琼脂糖凝胶；包被液为pH9.6、0.05mol/L的碳酸盐缓冲溶液，碳酸盐缓冲溶液含1.59g碳酸钠和2.93g碳酸氢钠，超纯水1L，封闭液为1％牛血清白蛋白溶液；其中，底物液A为含有过氧化氢或过氧化脲的pH4.0柠檬酸缓冲溶液；底物液B为含有3，3，5，5—四甲基联苯胺或邻苯二胺的pH4.0柠檬酸缓冲溶液；终止液为1mol/L盐酸溶液。洗涤液为含1％吐温-20的磷酸盐缓冲液，磷酸盐缓冲液pH值为7.4，浓度为0.05mol/L。

7.根据权利要求1所述的方法，其中，所述依替米星抗体是单克隆抗体，或Fab、Fv、ScFv、单域抗体。

8.一种依替米星检测用酶联免疫试剂盒，所述试剂盒中含有以下组分：依替米星抗体，所述抗体可以是单克隆抗体，或其Fab、Fv、ScFv及单域抗体。

9.根据权利要求8所述试剂盒，其中含有选自小鼠，兔，羊种两种不同种属的依替米星抗体。

10.根据权利要求8所述试剂盒，所述试剂盒中还可含有任何一种用于检测的试剂及其装载物，选自：酶标板、显色液、终止液、标准品，稀释液，缓冲溶液，等渗溶液，试剂瓶，说明书，面签，滴定管，取样器。