[发明专利]一种产β-榄香烯重组菌及其构建方法和用途

说明书

本发明公开了一种产β‑榄香烯重组菌株及其构建方法和应用，涉及代谢工程、合成生物学和生物制药等技术领域。该重组菌株表达来自加拿大一枝黄花的吉玛烯A合酶(ScGAS)，并引入包含大肠杆菌的atoB、idi、ispA和酿酒酵母的ERG13、tHMG1、ERG12、ERG8、MVD1重组质粒，经过发酵条件优化，该重组菌株的β‑榄香烯产量达到156.94mg/L。本发明中构建的重组菌具备产量高、纯度高、低成本、无污染等特点,适于工业化生产β‑榄香烯。

技术领域

本发明涉及代谢工程、合成生物学和生物制药等技术领域，特别涉及一种产β-榄香烯菌株的构建方法及用途。

背景技术

以β-榄香烯(β-elemene)为主要成分的榄香烯类化合物，为国家Ⅱ类非细胞毒性抗肿瘤新药。β-榄香烯具有诱导肿瘤细胞凋亡、抑制其增殖、转移和主动免疫保护等作用，临床上可以单独或与其他化疗药物联合用于治疗各种癌症，此外还具有抗氧化、抗菌、抗病毒、改善微循环等药效，因此具有良好医药价值和应用前景。

目前市场的β-榄香烯主要是从中药莪术中提取获得。该获取方法成本高、纯度低，而常规化学全合成方法的步骤繁琐、反应条件苛刻、得率低、环境不友好，限制了β-榄香烯的供给和应用。因此，寻找新的β-榄香烯经济可行的量产技术，对该类药物的推广应用具有重要意义。

合成生物学的发展，为规模化生产自然界中含量低、结构复杂、应用价值高的天然产物提供了新的方法。利用微生物生长速度快、周期短、成本低、遗传背景清楚有利于遗传改造等优点，通过构建重组细胞、异源重组天然产物的合成途径，已有快速、大量获取中间体和终产物的成功范例：在酿酒酵母中构建青蒿素的生物合成途径，其前体青蒿酸的产量达到25g/L(Paddon,C.J.,et al.Nature 496.7446(2013):528.)。

β-榄香烯是植物中比较常见的一类倍半萜类化合物，但目前尚无β-榄香烯合酶被克隆，β-榄香烯是由吉玛烯A经cope重排而来的，而吉玛烯A则是经吉玛烯A合酶催化底物法呢烯基焦磷酸FPP获得。研究开发一种快速、高产、环境友好的β-榄香烯的制备方法成为当前亟待研究的重要课题。

发明内容

鉴于此，本发明的目的是提供了一种产β-榄香烯菌株及其构建方法。本发明通过构建产生倍半萜类化合物的前体法呢烯基焦磷酸(FPP)的重组质粒和构建来源于加拿大一枝黄花(Solidago canadensis)的吉玛烯A合酶ScGAS重组质粒，获得含有上述重组质粒的大肠杆菌工程菌株，并通过优化温度、诱导剂浓度、诱导时间和诱导时菌液浓度，从而实现快速、高产地制备β-榄香烯。

为实现上述目的，本发明采取如下技术方案：

一种产β-榄香烯的重组菌，所述重组菌表达吉玛烯A合酶ScGAS、乙酰乙酰辅酶A硫解酶atoB、3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合酶ERG13、截短的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶tHMG1、甲羟戊酸激酶ERG12、磷酸甲羟戊酸激酶ERG8、焦磷酸甲羟戊酸脱羧酶MVD1、焦磷酸异戊烯脂异构酶idi和法呢烯基焦磷酸合酶ispA。

进一步地，所述吉玛烯A合酶ScGAS的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

进一步地，所述吉玛烯A合酶ScGAS的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示或如SEQ IDNO.3所示，