[发明专利]一种产β-榄香烯重组菌及其构建方法和用途

权利要求书

1.一种产β-榄香烯的重组菌，其特征在于，所述重组菌表达吉玛烯A合酶ScGAS、乙酰乙酰辅酶A硫解酶atoB、3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合酶ERG13、截短的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶tHMG1、甲羟戊酸激酶ERG12、磷酸甲羟戊酸激酶ERG8、焦磷酸甲羟戊酸脱羧酶MVD1、焦磷酸异戊烯脂异构酶idi和法呢烯基焦磷酸合酶ispA；

所述吉玛烯A合酶ScGAS的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；

所述吉玛烯A合酶ScGAS的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示或如SEQ ID NO.3所示，乙酰乙酰辅酶A硫解酶atoB的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合酶ERG13的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示、截短的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶tHMG1的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示、甲羟戊酸激酶ERG12的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示、磷酸甲羟戊酸激酶ERG8的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示、焦磷酸甲羟戊酸脱羧酶MVD1的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，焦磷酸异戊烯脂异构酶idi的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示、法呢烯基焦磷酸合酶ispA的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。

2.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于，所述吉玛烯A合酶ScGAS的表达载体为pGEX-4T1载体；所述乙酰乙酰辅酶A硫解酶atoB、3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合酶ERG13、截短的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶tHMG1、甲羟戊酸激酶ERG12、磷酸甲羟戊酸激酶ERG8、焦磷酸甲羟戊酸脱羧酶MVD1、焦磷酸异戊烯脂异构酶idi和法呢烯基焦磷酸合酶ispA的表达载体为pACYCDuet-1载体。

3.根据权利要求2所述的重组菌，其特征在于，所述乙酰乙酰辅酶A硫解酶atoB、3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合酶ERG13、截短的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶tHMG1的基因连接到pACYCDuet-1的多克隆位点MCS1，所述甲羟戊酸激酶ERG12、磷酸甲羟戊酸激酶ERG8、焦磷酸甲羟戊酸脱羧酶MVD1、焦磷酸异戊烯脂异构酶idi和法呢烯基焦磷酸合酶ispA的基因连接到pACYCDuet-1的多克隆位点MCS2。

4.权利要求2或3所述的重组菌的构建方法，其特征在于，主要包括以下步骤：

(1)将吉玛烯A合酶ScGAS基因连接到pGEX-4T1载体中，转化感受态细胞，挑取阳性克隆，提取重组质粒pGEX-4T1-ScGAS；

(2)将乙酰乙酰辅酶A硫解酶atoB基因、3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合酶ERG13基因、截短的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶tHMG1基因、甲羟戊酸激酶ERG12基因、磷酸甲羟戊酸激酶ERG8基因、焦磷酸甲羟戊酸脱羧酶MVD1基因、焦磷酸异戊烯脂异构酶idi基因和法呢烯基焦磷酸合酶ispA基因连接到pACYCDuet-1载体中，转化感受态细胞，挑取阳性克隆，提取重组质粒pACYCDuet-FPP；

(3)将步骤(1)所得的pGEX-4T1-ScGAS重组质粒和步骤(2)所得的pACYCDuet-FPP共同转化感受态细胞，挑取阳性克隆即得产β-榄香烯的重组菌株。

5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，步骤(3)中的感受态细胞为E.coilBL21(DE3)。

6.利用权利要求1-3任一项所述的重组菌生产β-榄香烯的方法，其特征在于，主要包括以下步骤：

(1)在转速50～300rpm，温度20～32℃的培养条件下，培养权利要求1-5任一项所述的重组菌，待重组菌液浓度A₆₀₀为0.2～2时，加入IPTG诱导剂至终浓度为0.01～1.0mM，继续培养至12-120h；

(2)使用有机溶剂萃取发酵液中的β-榄香烯，离心收集有机相，即得。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述培养的培养基为液体LB培养基。

8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于，所述有机溶剂为乙酸乙酯、己烷、石油醚或氯仿中的一种或2种以上的混合物，所述有机溶剂与发酵液的体积比2:1～1:20。